Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Zusammenfassung

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Zusammenfassung

Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern ^1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen ^2-5.

Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt ^4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden.

Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen ¹² leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.

Einleitung

Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle ¹ erfordert.

Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen ^13.

Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird ^14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen ^14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP ^16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine ​​mit glykolytischen Proteine ​​in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine ​​im TCA-Zyklus und Atmungskette ^13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen.

Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit ²⁰ niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit ¹⁷ Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um ^18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt.

Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei ^2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei ^12.

Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen ^25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine ​​wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert.

Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) ¹² verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren.

Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.

Protokoll

1. Allgemeine Trypanosom Haltung

1. Wiegen Feststoffe zur Herstellung SDM79 Medien (Tabelle 1).
2. Lagerung bei 4 ° C in 50 ml konischen oder einem Plastikbeutel. HINWEIS: Die Reagenzien sind für mindestens 6 Monate stabil.
3. Auftau fötalem Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad und periodisch mischen durch Umkehrung. HINWEIS: FBS wird vom Lieferanten als sterile Lösung erhalten. Filtersterilisieren FBS verringert seine Fähigkeit, das Wachstum des Parasiten zu unterstützen.
4. Sobald die gesamte Flasche aufgetaut, Hitze inaktiviert Serum für 30 min in einem 56 ° C Wasserbad, periodisch Mischen, um eine Ausfällung von Serumkomponenten zu minimieren.
5. Tauwetter Penicillin / Streptomycin-Lösung (Pen / Strep), Hämin (2 mg / ml in 50 mM NaOH) und Grundmedium Adler Vitamin-Lösung bei Raumtemperatur.
6. Um einen 1.000 ml-Messzylinder, fügen 20,2 g SDM79 Feststoffe (Tabelle 1) mit den flüssigen Komponenten (Tabelle 2) und gut mischen auf einer Rührplatte.
7. PH-Wert auf 7,35 und das Volumen auf 850 ml mit Wasser.
8. Filter sterilisieren Medien, indem ein Vakuumschlauch an der Unterseite des Filterflasche. Ziehe Vakuum bis die Lösung filtriert.
9. Filter entfernen oben in der biologischen Sicherheitsschrank und fügen Sie 150 ml hitzeinaktiviertem FBS. Kunststoffabdeckung entfernen aus sterilen Kappe und Dichtung Medien Flasche.
10. Vorbereitung SDM80 Medien in der gleichen Weise wie SDM79 mit folgenden Ausnahmen; nicht Glucose oder Glucosamin hinzufügen und MEM ohne Glutamin. Anstelle von 150 ml hitzeinaktiviertem FBS, fügen Sie 135 ml dialysiert, Hitze inaktiviert FBS und 15 ml hitzeinaktiviertem FBS.
11. Kultur PCF Parasiten in 25 cm ^2-Kolben mit 10 ml geeigneten Medium bei 27 ° C und 5% CO _2. Hinweis: Zellen sollten täglich mit einer Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer gezählt werden (siehe Abschnitt 6) und Kulturen sind bei Dichten zwischen 1 x 10 ⁵ und ⁵ x 10 ⁶ Zellen / ml gehalten werden.

2. Transfection von PCF Parasiten mit dem fluoreszierenden Reporterkonstrukt

HINWEIS: Um glycosome Dynamik zu folgen, ein Reporterprotein, das die peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) von Aldolase zu mehr gelb fluoreszierenden Protein fusioniert ist in den Parasiten ausgedrückt. Die Sequenz für das Fusionsprotein kodiert, in pXS2bla ^12, die den procyclin Promotor und die Tubulin intergenen Regionen, die direkt homologe Rekombination in das Genom und die Blasticin Resistenzgen zur Selektion enthält, kloniert. Prozyklischen Zelllinien, die Gene beherbergen, die T7-Polymerase und Tetracyclin-Repressor (PF29-13) kodieren, sind mit dem Targeting-Konstrukt, pXS2 verwandelt: PTS2eYFP.

1. Bereiten cytomix durch Mischen der in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren und lagern bei RT.
2. Linearisieren von Plasmid-DNA mit MluI durch Pipettieren von 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul Restriktionsenzym-Puffer, 33 ul Wasser und 2 μL MluI Enzyms in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde.
3. Reinige den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1 Volumen von Bindungspuffer zu dem Restriktionsenzym-Verdau. Mischen Bindungspuffer und verdauten DNA durch Verwirbelung. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
4. Legen Sie eine DNA-bindende Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen, und Übertragung verdaute DNA / Bindungspufferlösung Spalte.
5. Zentrifuge für 10.000 g für 1 min. Nach der Zentrifugation verworfen Filtrat von Sammelröhrchen und gibt die Spalte an die Sammelröhrchen.
6. Fügen Sie 700 ul Waschpuffer SPW und Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min.
7. Verwerfen Filtrat von Sammelröhrchen, kehren die Spalte an die Sammelröhrchen und wiederholen SPW Waschschritt und Zentrifugieren.
8. Verwerfen Filtrat, Rück Spalte Sammelröhrchen und Zentrifuge leere Spalte für 3 min bei 10.000 × g Rest Ethanol zu entfernen.
9. In einer biologischen Sicherheitsschrank, wegwerfen colwahl Rohr und Ort Spalte in einem sterilen Reaktionsgefäß.
10. Zur Elution der DNA, fügen Sie 25 ul sterilem Wasser auf Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifugieren bei 10000 × g für 1 min.
11. Fügen Sie weitere 25 ul sterilem Wasser in biologischen Sicherheit Haube Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min.
12. Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min.
13. In einer biologischen Sicherheitsschrank übertragen gesamte Volumen der DNA auf eine neue sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Dieser Schritt verhindert die Kontamination von der offenen Deckel während der Zentrifugation.
14. Hinzufügen des sterilen, gereinigt linearisierte DNA (10 ug) in 400 ul sterilfiltriert cytomix.
15. Zählen von Zellen, wie in Abschnitt 6 durch Zentrifugation bei 800 g für 15 min bei RT beschrieben und ernten 5 x10 ⁷ -10 ⁸ Zellen.
16. Überstand abgießen und Zellpellet in 450 ul DNA + cytomix mit einer 1 ml serologische Pipette.
17. Transfer-Lösung enthält ce lls, DNA und cytomix in ein steriles Abstand von 4 mm Küvette und Ort in der Küvette Elektroporationskammer.
18. Wählen Sie "exponentiellen Abfall" und geben Sie manuell die folgenden Einstellungen: Spannung: 1,5 kV, Kapazität: 25 mF, Widerstand: Ω und Küvette: 4 mm. Drücken Puls. Sobald der Impuls beendet ist, entfernen Küvette aus dem Elektroporationskammer und zum Biosicherheitswerkbank.
19. In eine neue sterile Flasche, Pipette 10 ml SDM79. Übertragen der transformierten Zellen in den Kolben mit 10 ml SDM79.
20. Inkubieren ohne Arzneimittel Selektion für 24 h bei 27 ° C, 5% CO _2. Nach 24 Stunden hinzu G418 (15 ug / ml), Hygromycin (50 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformierten Zellen mit Drogen in 9 ml SDM79 mit Drogen.
21. Analysieren Sie die Zellen täglich, wie in Abschnitt 6 und 7. Wenn Zellen fluoreszierende sind beschrieben und haben eine Zelldichte von 1 x 10 ⁷ / ml erreicht, stellen stabilates für die Langzeitspeicherung (3.1-3.3).

ve_title "> 3. Erstellen Stabilates

1. Um das Einfrieren Medien, ein gleiches Volumen von 100% Glycerin zu cytomix und Filter sterilisieren.
2. Geben Sie 200 ul des Einfrierens Medien bis 800 ul von Zellen (1 x 10 ⁷⁾ in einem Kryoröhrchen, vorsichtig mischen und Inversion zwischen zwei Styropor-Racks und frieren bei -80 ° C.
3. Einmal gefroren (~ 24 h), Transfer Zellen in flüssigen Stickstoff. HINWEIS: Es ist wichtig, Zellen in LN ₂ nach 24 h bei -80 bewegen, wie eine längere Lagerung ° C führt zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen.

4. Auftauen Aktien

1. Entfernen gefrorenen Ampulle von -80 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur für etwa 10 min.
2. Pipette 9 ml SDM79 mit Drogen in eine neue sterile Flasche. Fügen Sie aufgetauten Zellen zu diesen Kolben. Geben Zellen 1:10 Zugabe von 1 ml dieser Kultur in 9 ml SDM79 in einen neuen Kolben (Endkonzentration von 1 x 10 ⁵ / ml).
3. Bevor die Zellen eine Dichte von 10 ⁷ / ml erreichen, beginnen Durchflusszytometer eingestelltund Verdünnungsanalysen.

5. Durchflusszytometer-Setup

1. Schalten Sie das Durchflusszytometer und CFlow Plus-Programm zu öffnen. HINWEIS: Bevor Sie irgendwelche Proben sollten die Fluidik gemäß den Schritten 5,2-5,7 rückgespült und ausgespült werden.
2. Ersetzen Sie den Schlauch von Nanopure Wasser, in dem die SIP ist mit einem Leerrohr gespeichert.
3. Wählen Sie die "Rückspülung"-Taste.
4. Nach Rückspülung abgeschlossen ist, entfernen Mikrozentrifugenröhrchen von Schluck und entsorgen.
5. Legen Sie eine neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml neuen nanoreinem Wasser auf dem Schluck.
6. Wählen Sie einen neuen Brunnen in CFlow Programm. Unter "Ausführen Limits" eingestellte Zeit für 2 min. Unter "Fluidtechnik" wählen Sie "schnell" und "Ausführen".
7. Sobald die 2 min Frist abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche "Löschen Beispieldaten".

6. Zellzählung mit dem Durchflusszytometer

1. Wasser zu ersetzen mit der Probe, die gezählt werden. Set "Führen Limits "bis 30 Sekunden", Fluidik "auf" schnell "und wählen Sie dann" Ausführen ".
2. Nach Ablauf der 30 Sekunden Frist abgeschlossen ist, CFlow Plus wird die Ereignisse / ul unter "Last Run". Zahl für jede Kultur Wiederholen bieten. HINWEIS: Bevor Zellen erreichen 1 x 10 ⁷ Zellen / ml, fahren Sie mit Verdünnungsanalyse. Zellen sollten nicht fort nach einer Verdünnungsanalyse abgeschlossen ist. Zellen für längere Zeiträume kultiviert verlieren ihre Fähigkeit, sich an Umweltbedingungen zu reagieren.

7. Messung der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer

1. , Um die Fluoreszenz zu beurteilen, setzen Sie "Run Limits" zu 10.000 Ereignisse und "Fluidtechnik" auf "langsam". Wählen Sie "Schwelle". Unter "Primary Threshold", wählen Sie "dauerhaft zu beseitigen Veranstaltungen", "FSC-H" (in Drop-Down-Box) und geben Sie weniger als 30.000. Klicken Sie auf "Übernehmen" und dann auf "Schließen".
2. Wählen Sie die220; Histogramm "-Taste in einem der neuen Plot-Fenster und wählen Sie" FSC-A "aus der Dropdown-Liste, wählen Sie" FL1-A ". HINWEIS: FL1-A Maßnahmen Fluoreszenz in der 530 nm Wellenlänge.
3. Wählen Sie "Ausführen" und wiederholen Sie für alle Kulturen.
4. Führen Sie die Reinigungslösung durch die Fluidik Linie für 2 Minuten und Wasser für 2 min.

8. Verdünnungsanalysen

1. Geben Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 ⁵ Zellen / ml in 3 ml SDM79 in einer 25 cm ² Kulturflasche und Messen Fluoreszenz unmittelbar nach Durchgang und dann 3 Stunden und 24 Stunden.

9. Datenanalyse

1. Wählen Sie "Analysieren" Vorsprung auf CFlow Plus an.
2. Klicken Sie wird "Histogramm" unter "Machen Sie eine neue Handlung." Wählen einer Dropdown-Liste "FSC-A" und erscheinen. Wählen Sie den Kanal "FL1-A."
3. Markieren Sie eine gut zu analysieren. Wählen Sie "Gate"-Taste und manuell zeichnen eine Gate-für die Bevölkerung von Interesse.
4. Flow Plus liefert Zelle "Count" in diesem Tor und "% dieser Plot".

Ergebnisse

In diesem System wurde eine glucoseabhängige Änderung glycosome Zusammensetzung beobachtet. Wenn Zellen in Glucose enthaltenden Medien gezüchtet werden zwei Populationen beobachtet; eine helle und eine dim (Abbildung 2a). Dim Zellen beherbergen unreifen Glykosomen, die nicht importiert haben die PTS2eYFP während helle Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Glykosomen ^12. Wenn Glukose in den Medien vorhanden ist, ist Fehllokalisation von Proteinen tödliche glycosome

Diskussion

Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation