评估隔离肺泡巨噬细胞的激光共聚焦显微镜抗真菌活性

摘要

一种方法来评估分离的小鼠肺泡巨噬细胞，激光共聚焦显微镜，以控制吞噬曲霉菌孢子的生长的能力。

摘要

肺是其中的宿主细胞经常接触到的微生物和微生物产品的接口。肺泡巨噬细胞是遇到吸入真菌和其它微生物的一线吞噬细胞。巨噬细胞和其他免疫细胞识别曲霉图案由病原体识别受体，并启动下游的炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶产生活性氧中间体（投资回报）​​，是宿主防御的关键。虽然NADPH氧化酶是至关重要的中性粒细胞介导的宿主防御^{1 - 3，NADPH}氧化酶的巨噬细胞中的重要性是不明确的。本研究的目标是界定在介导针对A.宿主防御NADPH氧化酶的巨噬细胞中的具体作用曲霉 。我们发现，在肺泡巨噬细胞NADPH氧化酶控制吞噬A的增长烟曲霉菌孢子^4。在这里，我们描述了一种用于评估老鼠的能力lveolar巨噬细胞（AMS）来控制细胞吞噬黑曲霉的孢子（分生孢子）的生长。肺泡巨噬细胞进行染色体内并通过支气管肺泡灌洗（BAL）从小鼠十天后分离。巨噬细胞被镀到玻璃盖玻片上，然后种入绿色荧光蛋白（GFP）表达A.烟曲霉菌孢子。在指定的时间，将细胞固定和完好的巨噬细胞与吞噬孢子的数量通过共聚焦显微镜进行评估。

引言

肺泡巨噬细胞是遇到吸入微生物一线吞噬细胞。巨噬细胞识别黑图案由病原体识别受体，摄取并限制吸入孢子（分生孢子）的生长，并启动炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶转化分子氧超氧阴离子和下游活性氧中间体（投资回报）​​。慢性肉芽肿病（CGD）是NADPH氧化酶的特征是严重的细菌和真菌感染和由过度的炎症反应的一种遗传性疾病。

虽然NADPH氧化酶是至关重要的中性粒细胞介导的宿主防御^{1 - 3，NADPH}氧化酶的巨噬细胞中的重要性是不明确的。此前的研究表明，肺泡巨噬细胞摄取并杀死曲霉菌孢子，而中性粒细胞主要针对菌丝阶段^5。但是，也出现了相互矛盾的雷苏尔TS作为NADPH氧化酶在巨噬细胞中控制A的生长的作用曲霉孢子^6,7。

该方法的目标是界定在介导针对A.宿主防御NADPH氧化酶的巨噬细胞中的具体作用烟曲霉菌孢子。我们发现，在肺泡巨噬细胞NADPH氧化酶控制吞噬A的增长烟曲霉菌孢子^4。为了最准确地模拟主机对吸入真菌，我们使用了支气管肺泡灌洗收集肺泡巨噬细胞的未刺激小鼠紧随牺牲。使用隔离的肺泡巨噬细胞使我们能够专注于自己的抗真菌活性在没有其他免疫细胞（ 如中性粒细胞招募）， 在体内防御曲霉 。在该方法中，肺泡巨噬细胞进行染色在事先体内收获，以尽量减少收获后的操作量。

另一个优点这个协议是使用GFP表达A的曲霉菌株。这种真菌表达从分生孢子阶段GFP通过菌丝阶段，并没有必要进一步染色。以获得具有更详细的图像，我们选择了共焦显微镜使从所获得的图像的三维结构的重建。三维重建给出菌丝生长周围，而不是在或通过巨噬细胞之间进行区分的能力。分生孢子也可以精确地辨别作为细胞内与细胞外。

研究方案

动物在这项研究中执行的所有程序批准了动物护理和使用委员会在罗斯威尔公园癌症研究所和遵守所有州，联邦和卫生法规国家机构。

1， 在体内巨噬细胞标记

注意:PHK26是将要采取由吞噬细胞在血液循环和在组织中静脉内给药（IV）时，亲脂性染料。 PKH26用于体内标记，以减少收获后处理的巨噬细胞的数量。 PKH-26具有稳定地积聚在肺泡巨噬细胞的延长期的优势。给药后10天等待允许从循环只留下肺泡巨噬细胞稳定标记PKH26 ^8,9所有标记细胞的间隙。 PKH26是一个红色的荧光，具有激发（551 nm）和发射（567 nm）的特性兼容罗丹明或藻红蛋白的检测系统。任何标记过程可以介绍的神器，其中包括生存能力的丧失。然而，由于我们使用的巨噬细胞的标记以同一方法，不同的鼠标基因型（ 例如 ，WT与NADPH氧化酶缺陷），这些文物的影响将是统一的。

1. PKH26稀释的原液（乙醇1×10 ^-3 m）在由制造商提供的稀释液1:5。
2. 负载100μl的稀释PKH26成1/2 20ng/ml胰岛素注射器（29克X 1/2"）对每只小鼠。
3. 通过静脉注射（或尾静脉或眶）至少10天，收获前管理到小鼠。

2，收获肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗（BAL）

小鼠用于实验的数目可以变化。一个典型的产量从未受刺激的小鼠是在3-5×10 ⁵肺泡巨噬细胞的范围内，但这个数字也相差很大BAS版上的因素，如进行灌洗者的鼠标，经验大小和灌洗液和从肺中排出的体积的滴注的数量。在这个协议中肺灌洗是一个封闭胸腔它伴随着反复1毫升灌洗有助于提高细胞产量进行。

1. 通过使用无菌条件下，保持溶液的无菌管理致死剂量阿佛丁麻醉剂（12.5毫克），腹腔（IP）安乐死鼠标。
2. 用70％乙醇彻底喷鼠标。
3. 从动物的颅年底去除皮肤暴露胸部（ 图1A）。
   1. 做一个小切口在皮肤只是隔膜下方。
   2. 将手指插入切口，拉皮肤远离动物（ 图1A）的颅结束。
   3. 向上推略微的头，延长颈部腹侧（ 图1A）。
4. 通过切左肋一个小孔进入右侧胸廓放气肺和也允许在以下步骤中的肺的可视化。
5. 找到气管，并认真剖析了周围的组织。
   1. 取出唾液腺，胸骨舌骨肌和喉等用弯钳。
   2. 小心地抬起了弯钳和切去，用剪刀薄组织覆盖气管（外膜）揭示的基本环状软骨结构。
6. 将导管插入气管。
   1. 用弯钳，放置缝合后面（背侧）的气管，并通过开口拉一个10cm的长度。
   2. 启动环状（软骨环增厚）上面仔细地引导22政导管下来气管停在那里气管消失胸骨后面。
   3. 紧紧绑周围缝合气​​管导管到舒适的位置。从导管取出针头。
7. 装配4路阀。
   1. 填1个6毫升注射器用DPBS，1％FBS和附加到4路阀， 如图1B所示。
   2. 附上一个空6毫升在注射器上的4路阀（ 图1B）所指示的位置。
   3. 重视开放端口上的活塞，以导管4路（ 图1B）。注意不要从气管导管打跑。
8. 从收集肺灌洗液。
   注:调查人员可以选择使用肺泡灌洗液中下三卷，以尽量减少组织损伤的可能性。那同样的方法在所有小鼠组被贯彻应用是很重要的。
   1. 所以转空注射器被关闭的水龙头把手， 慢慢地注入约1mL DPBS，1％FBS膨胀的肺。通过切孔在步骤2.4观察肺胀。
   2. 要小心，不要过度膨胀的肺。
   3. 打开水龙头手柄，使之充分注射器被关闭，并仔细撤回流感 ID从肺部。
   4. 观察肺放气通孔切割步骤1.4。导管可能需要移动稍微向后或向前来获得一个很好的借鉴。采取特殊的预防措施，以保持导管气管内。
   5. 重复步骤2.8.1-2.8.4 5-6倍，直到所有的DPBS，1％FBS的已注入和从肺部排出。注意:肺液的回收将不注射液的100％。
9. 空注射器灌洗液到50ml锥形管中。保持细胞在室温下。
10. 通过在300 XG离心5分钟，在室温下沉淀细胞，并倒出上清液。这样如果需要，可以保存用于细胞因子分析。
11. 重悬的细胞在1-5毫升的RPMI 1640含10％FBS和血细胞计数器计数。在未刺激的小鼠，> 95％的细胞由BAL收获的预计是巨噬细胞，这可以通过细​​胞学进行确认。

3，培养和收获真菌

">在这个协议中使用的烟曲霉表达绿色荧光蛋白在其整个生命周期的各个阶段:孢子，germlings和菌丝这种真菌菌株是由马戈·摩尔博士，西门菲沙大学，伯纳比，不列颠哥伦比亚省，加拿大提供。

1. 在沙氏脑心脏浸液（BHI）琼脂斜面用氯霉素（0.05克/升）和庆大霉素（0.5克/升）表达GFP的烟曲霉菌株的分生孢子盘。
2. 在孵育在室温下松瓶盖为7〜10天的黑暗。
3. 收获分生孢子通过倾斜洗涤用10毫升0.01％吐温20的DPBS。轻轻刮除木耳与stripette松动。冲洗斜几次，以增加产量。
4. 通过100微米的细胞过滤网通过分生孢子悬浮液置于50ml锥形。
5. 粒料分生孢子在400×g离心离心10分钟。
6. 分生孢子重悬在50毫升的DPBS和计数使用血球。
7. 用DPBS洗两次并稀释至所需浓度滤过。

4，真菌挑战和共聚焦显微镜

为了研究巨噬细胞NADPH氧化酶在宿主防御中的作用，从三种基因型控制吞噬曲霉菌孢子的生长小鼠分离的肺泡巨噬细胞的能力进行了评估。在本研究中使用的基因型包括; 1）野生型小鼠，2）NCF1 * / *锰小鼠的天然存在的突变NCF1（NCF1编码为P47 ^PHOX，吞噬细胞的NADPH氧化酶的必需组分）离开他们的NADPH氧化酶缺陷型，和3）NCF1 * / *锰+转基因小鼠（MN表示该转基因携带野生型NCF1人类CD68启动子的控制下），其中NADPH氧化酶活性已被重新溶解在单核细胞/巨噬细胞群^10，11。

共聚焦显微镜最适合于该试验中，由于存在和在幻灯片非吞噬的分生孢子的生长。共焦显微镜将允许在Z轴中的各个平面的可视化，并且使真菌生长围绕，而不是内巨噬细胞之间的差异。所有的共聚焦图像是使用63X油浸镜头获得的。 Z-栈收购与2.5电子的变焦倍数。一个Z-堆栈的厚度是用DAPI和亮场图像的定位字段的顶部和底部的确定。 Z-堆栈介乎14至24微米，个别切片〜1微米厚。巨噬细胞的定量，1X电子变焦的单扫描每基因型的10个字段分别进行。被确定完整的巨噬细胞的基础上分别PKH26和膜和细胞核的DAPI染色。分生孢子的基础上确定的FITC表达和亮场图像。

1. 准备无菌盖玻片和板
   1. 下一个生物安全柜，浸泡22×22毫米的玻璃盖玻片在70％桥亚乙基升5-10分钟。
   2. 在无菌PBS冲洗盖玻片。
   3. 用无菌镊子，轻轻地放在一个单独的盖玻片在无菌单独包装的6孔板的每个孔的底部。
2. 种子〜1×10 ⁶个收获的PKH26标记的肺泡巨噬细胞悬浮于300微升的RPMI 1640，10％FBS到每个盖玻片。取决于收获产量的确切数量可以改变。
3. 让巨噬细胞在37℃温育，用5％的CO ₂过夜以粘附。
4. 第二天早晨，加〜1×10 ⁷表达GFP的A。曲霉分生孢子悬浮于100μl预热的（37℃）的RPMI 1640，10％FBS。
5. 返回板到37℃培养箱中，用5％的CO _2。
6. 细胞应该被固定为至少2小时，室温过夜或在4℃下在3,7和14小时修复细胞，加入2％的甲醛等体积到各孔中（最终浓度1％的甲醛）。地方板的在4℃下早期时间点过夜。在最后的时间点（14小时），固定的细胞在室温下搅拌2小时。
7. 固定后，使用镊子轻轻取出盖玻片和冲洗的DPBS。
8. 放置盖玻片的边缘折叠的Kimwipe去除多余的液体。
9. 适用于6微升荧光封固剂用DAPI到玻璃显微镜载片。
10. 莱盖玻片的一个边缘上的幻灯片，并与细胞侧轻轻下拉到安装介质。安装介质将蔓延并形成均匀的一层盖玻片下方。有没有必要压在盖玻片。
11. 密封盖玻片的边缘与透明指甲油，并在空气中晾干。
12. 店准备的幻灯片在幻灯片框（避光），在室温下，直到准备通过共聚焦显微镜来分析。

结果

从未经刺激的小鼠收集肺泡巨噬细胞通过BAL将导致基于细胞学一个纯度> 95％的人口​​。在3和7小时（ 图2）的时间点之前的真菌生长的菌丝阶段，并允许对分生孢子的基因型之间的吞噬效率的比较。其中基因型可以是关于抑制吞噬的分生孢子于组织侵入菌丝阶段的过渡（ 图3）的能力进行比较，在14小时的时间点是。完好的巨噬细胞可以通过共聚焦显微镜的基础上...

讨论

使用这种方法进行体外分析巨噬细胞的抗真菌活性连同体内真菌的挑战，我们先前表明，在巨噬细胞NADPH氧化酶起着抵御A的重要作用烟^4。使用隔离的肺泡巨噬细胞使我们能够专注于他们的抗真菌活性在没有其他免疫细胞（ 如中性粒细胞招募）， 在体内防御曲霉 。

各种可视化策略已经被用于评价巨噬细胞的抗真菌活性

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope