Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Zusammenfassung

Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr ^{werden 1 - 3,} die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen ^4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Einleitung

Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen.

Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr ^{werden 1 - 3,} die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe ^5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen ^{6, 7.}

Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen ^4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren.

Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.

Protokoll

Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften.

1. In-vivo-Makrophagen-Labeling

Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für in vivo-Markierung verwendet, um die Menge der nach der Ernte Manipulation der Makrophagen zu minimieren. PKH-26 hat den Vorteil, stabil zu der sich in alveolären Makrophagen während längerer Zeit. Warten Sie 10 Tage nach der Verabreichung ermöglicht Clearance von allen markierten Zellen aus dem Verkehr so dass nur Alveolarmakrophagen stabil beschriftet mit PKH26 ^{8, 9.} PKH26 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Anregung (551 nm) und Emission (567 nm) hat Eigenschaften kompatibelmit Rhodamin oder Phycoerythrin Detektionssysteme. Jede Markierungsverfahren kann Artefakt vorstellen, einschließlich Verlust der Lebensfähigkeit. Da wir den gleichen Ansatz für die Kennzeichnung von Makrophagen in verschiedenen Maus-Genotypen (zB WT vs NADPH-Oxidase-Mangel), die Auswirkungen dieser Artefakte wäre Uniform.

1. Verdünnen Stammlösung von PKH26 (1 x 10 ^-3 M in Ethanol) 1:5 in Verdünnungsmittel C durch den Hersteller zur Verfügung gestellt.
2. Last 100 ul verdünnt PKH26 in einem 1/2 ml Insulin-Spritze (29 G x 1/2 ") für jede Maus.
3. Verabreichen Mäusen durch iv-Injektion (entweder Schwanzvene oder retro-Orbital) mindestens 10 Tage vor der Ernte.

2. Ernten Alveolarmakrophagen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL)

Die Anzahl der Mäuse, für ein Experiment können variieren. Eine typische Ausbeute aus einer nicht-stimulierten Maus ist im Bereich von 3-5 x 10 ⁵ Alveolarmakrophagen, aber diese Zahl kann stark variieren based von Faktoren wie Größe des Maus Erfahrung der Person, die die Spülung und die Anzahl der Instillation von Spülflüssigkeit und das Volumen von Lungen entnommen. In diesem Protokoll Lungenspülung mit einem geschlossenen Brusthöhle, die zusammen mit 1 ml Spülungen wiederholt hilft, die Zellausbeute zu erhöhen geführt.

1. Euthanize Maus durch Verabreichung einer tödlichen Dosis des Narkose Avertin (12,5 mg) intraperitoneal (ip) unter aseptischen Bedingungen, um die Lösung steril zu halten.
2. Spray Maus gründlich mit 70% igem Ethanol.
3. Entfernen der Haut aus dem kranialen Ende tierischen Aussetzen des Thorax (Fig. 1A).
   1. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut direkt unterhalb des Zwerchfells.
   2. Legen Sie den Finger in den Ausschnitt und ziehen die Haut von der Schädel Ende des Tieres (Abb. 1A).
   3. Drücken Sie leicht auf den Kopf, Erweiterung der Bauchseite des Halses (Abb. 1A).
4. Schneiden Sie ein kleines Loch in den Brustkorbin die rechte Seite des Brustkorbs, die Lungen entleeren und erlauben auch die Visualisierung der Lungen während der folgenden Schritte.
5. Suchen Sie die Luftröhre, und sorgfältig sezieren entfernt umgebende Gewebe.
   1. Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Muskeln und M. sternohyoideus Kehlkopf, etc. mit einer gebogenen Pinzette.
   2. Vorsichtig mit einem gebogenen Pinzette heben und schneiden mit einer Schere die für den Luftröhre (Adventitia) enthüllt die zugrunde liegenden beringt Knorpelstruktur dünne Gewebe.
6. Legen Katheter in die Luftröhre.
   1. Mit einer gebogenen Pinzette, legen Sie einen Faden hinter (dorsal) der Luftröhre und ziehen einen 10 cm Länge durch die Öffnung.
   2. Ab über dem Ring (die Verdickung der Knorpelring) vorsichtig führen einen 22-G-Katheter der Luftröhre nach unten zu stoppen, wo die Luftröhre verschwindet hinter dem Brustbein.
   3. Fest binden Naht um Luftröhre und Katheter für eine eng anliegende Passform. Entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter.
7. Montieren 4-Wege-Hahn.
   1. Fülleneine 6-ml-Spritze mit DPBS, 1% FBS und heften sich an 4-Wege-Hahn, wie in 1B angegeben.
   2. Bringen Sie eine leere 6-ml-Spritze an der angegebenen Position auf der 4-Wege-Hahn (Abbildung 1B).
   3. Bringen offenen Port auf dem 4-Wege-Hahn zum Katheter (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, Katheter aus der Luftröhre nicht zu lösen.
8. Sammeln Spülflüssigkeit aus der Lunge.
   Hinweis: Die Ermittler können sich für geringere Volumina an Waschflüssigkeit verwenden, um die Möglichkeit einer Schädigung des Gewebes zu minimieren. Es ist wichtig, dass der gleiche Ansatz konsistent in allen Mausgruppen angewendet werden.
   1. Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die leere Spritze geschlossen und langsam injizieren ~ 1 ml DPBS, 1% FBS Lungen aufzublasen. Beachten Lungen Inflation durch das Loch geschnitten in Schritt 2.4.
   2. Achten Sie darauf, um die Lungen overinflate.
   3. Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die volle Spritze geschlossen ist, und ziehen Sie vorsichtig die Grippe id aus der Lunge.
   4. Beachten Sie die Lunge durch das Loch geschnitten in Schritt 1.4 entlüften. Der Katheter kann brauchen, um etwas vor oder zurück bewegt werden, um einen guten Zug zu bekommen. Besondere Vorsichtsmaßnahme, um den Katheter in die Luftröhre zu halten.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1-2.8.4 5-6x bis alle DPBS, 1% FBS wurde injiziert und aus den Lungen entnommen. Hinweis: Erholung der Lungenflüssigkeit nicht 100% der injizierten Flüssigkeit.
9. Leere Spritze mit Spülflüssigkeit in einem 50 ml konischen Röhrchen. Halten Zellen bei Raumtemperatur.
10. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand abgießen. Dies kann beispiels Zytokinanalyse falls gespeichert werden.
11. Die Zellen in 5.1 ml RPMI 1640 mit 10% FBS und zählen auf eine Zählkammer. In der nicht stimulierten Maus> 95% der Zellen durch BAL geerntet werden erwartet, Makrophagen, die zytologisch bestätigt werden kann.

3. Kultivierung und Ernte Pilz

"> Die in diesem Protokoll verwendet Aspergillus fumigatus drückt GFP in allen Phasen des Lebenszyklus:. Sporen, Keimlinge und Hyphen Diese Pilzstamm wurde von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada bereitgestellt.

1. Platte Konidien von Aspergillus fumigatus, die GFP-Stamm auf Sabouraud-Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Schrägkulturen mit Chloramphenicol (0,05 g / l) und Gentamycin (0,5 g / L).
2. Im Dunkeln lose für 7 bis 10 Tage bei Raumtemperatur verschlossen.
3. Ernte Konidien durch Waschen Schräg mit 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Leicht kratzen den Pilz mit der Stripette zu lockern. Spülen Sie mehrmals die Schräge, um die Ausbeute zu erhöhen.
4. Geben Konidiensuspension durch ein 100 &mgr; m-Zellsieb in ein 50-ml-Erlen.
5. Pellet Konidien durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min.
6. Resuspendieren Konidien in 50 ml DPBS und zählen mit einer Zählkammer.
7. Zweimal waschen mit DPBS verdünnt und auf die gewünschte Konzentrationtration.

4. Pilz Herausforderung und konfokale Mikroskopie

Um die Rolle von Makrophagen-NADPH-Oxidase der Wirtsabwehr zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der isolierten alveolaren Makrophagen von Mäusen, die drei Genotypen, um das Wachstum von Aspergillus-Sporen phagozytiert Steuerung ausgewertet. Die in dieser Studie verwendeten Genotypen umfassen; 1) Wildtyp-Mäusen, 2) NCF1 * / * Mn-Mäuse mit einem natürlich vorkommenden NCF1 Mutation (NCF1 kodiert für p47 ^phox, eine erforderliche Komponente des Phagozyten NADPH-Oxidase) verlassen sie NADPH-Oxidase-Mangel, und 3) NCF1 * / * Mn + transgenen Mäusen (MN bezeichnet das Transgen beherbergen NCF1 Wildtyp unter der Kontrolle des humanen CD68-Promotor) wo NADPH-Oxidase-Aktivität wurde in der Monozyten / Makrophagen-Population ^{10, 11} wieder hergestellt ist.

Konfokalen Mikroskopie ist für diesen Test geeignet sind aufgrund des Vorhandensund das Wachstum von nicht-phagozytierten Konidien auf den Folien. Das konfokale Mikroskop wird zur Visualisierung der einzelnen Ebenen in der Z-Achse zu ermöglichen, und ermöglichen die Differenzierung zwischen Pilz wächst um als innerhalb Makrophagen. Alle konfokale Bilder werden mit einem 63X Ölimmersion erworben. Z-Stapel sind mit einem elektronischen Zoom-Faktor von 2,5 erworben. Die Dicke einer Z-Stapel wird mit DAPI und Hellfeld-Bilder, um die Ober-und Unterseite des Feldes zu finden bestimmt. Z-Stapel reichte von 14 bis 24 um mit einzelnen Scheiben ~ 1 um dick. Zur Quantifizierung der Makrophagen, wurden einzelne Scans von 1X elektronische Zoom auf 10 Felder pro Genotyp durchgeführt. Intakten Makrophagen wurden basierend auf PKH26 und DAPI-Färbung der Membran und Kern bzw. identifiziert. Konidien wurden auf der Grundlage FITC-Expression und Hellfeldbild identifiziert.

1. Bereiten Sie sterile Deckgläser und Teller
   1. Unter einem biologischen Sicherheitsschrank, genießen 22 x 22 mm Deckgläschen in 70% Ethanol für 5-10 min.
   2. Spülen Deckgläser in sterilem PBS.
   3. Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig legen Sie eine einzelne Deckglas im Boden jeder Vertiefung einer sterilen einzeln verpackt 6-Well-Platte.
2. Samen ~ 1 x 10 ⁶ geerntet PKH26 markiert alveolären Makrophagen in 300 ul RPMI 1640 10% FBS auf jedes Deckglas. Die genaue Zahl kann je nach Erntemenge variieren.
3. Makrophagen zu ermöglichen, durch Inkubation bei 37 ° C mit 5% CO ₂ über Nacht anhaften.
4. Am folgenden Morgen, fügen ~ 1 x 10 ⁷ GFP-exprimierenden A. fumigatus Konidien in 100 &mgr; l vorgewärmtes (37 º C) RPMI 1640, 10% FBS suspendiert.
5. Das Rückplatte auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2.
6. Zellen sollten für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C fixiert werden Bei 3, 7 und 14 Stunden fix Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2% Formaldehyd in jede Vertiefung (Endkonzentration 1% Formaldehyd). Platz Platten für diefrühen Zeitpunkten bei 4 ° C über Nacht. Für die endgültige Zeitpunkt (14 h), fix Zellen bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
7. Nach der Fixierung vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, Deckgläser und spülen in DPBS.
8. Überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem der Rand des Deckglases auf einem gefalteten Kimwipe.
9. Bewerben 6 ul Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Glasobjektträger.
10. Legen Sie eine Kante des Deckglases auf dem Objektträger und sanft fallen mit der Zellseite nach unten in die Montage Medium. Montagemedium verteilt und bilden eine gleichmäßige Schicht unter der Deckglas. Es gibt keine Notwendigkeit, sich auf dem Deckglas gedrückt wird.
11. Siegel Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack und an der Luft trocknen.
12. Shop vorbereitet Träger in einen Objektkasten (lichtgeschützt) bei Raumtemperatur, bis Sie sie durch konfokale Mikroskopie analysieren.

Ergebnisse

Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem> 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen we...

Diskussion

Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. ⁴ fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope