Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Özet

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Özet

Akciğer konak hücreler rutin mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz bir arayüz. Alveoler makrofajlar inhale mantar ve diğer mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, patojen tanıyan reseptörler ile Aspergillus motifleri tanımak ve alt-enflamatuar cevap başlar. Phagocyte NADPH oksidaz reaktif oksijen ara ürünleri (ROI) üretir ve konak savunma için önemlidir. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için ^1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Bu çalışmanın amacı A'ya karşı konak savunmasını arabuluculuk makrofajlarda NADPH oksidaz belirli bir rol tasvir oldu fumigatus. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus ⁴ sporlar. Burada, fare yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem tariffagosite Aspergillus sporlar (conidia) büyümesini kontrol etmek için lveolar makrofajlar (AMS). Alveol makrofajlarının, in vivo olarak, lekeli ve on gün sonra, bronkoalveoler lavaj (BAL) ile farelerden izole edilmiştir. Makrofajlar, cam kapak slipleri üzerine plakalanmıştır, daha sonra yeşil floresan protein (GFP)-ifade eden A ile tohumlandı fumigatus sporlar. Belirtilen zamanlarda, hücreler sabitlenir ve fagosite sporlarla sağlam makrofaj sayısının konfokal mikroskobu ile tespit edilir.

Giriş

Alveoler makrofajlar inhale mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar, patojen tanıma reseptörleri tarafından Aspergillus motiflerini tanımak yemek ve teneffüs sporlar (konidia) büyümesini sınırlamak ve enflamatuar cevabı başlatabilir. Fagosit NADPH oksidaz, süperoksit anyon ve aşağı doğru, reaktif oksijen ara (ROI) moleküler oksijen dönüştürür. Kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) ciddi bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar ve aşırı inflamatuar yanıtlar ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır.

NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için ^1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Önceki çalışmalar nötrofiller esas hifal sahne ⁵ hedef ise alveolar makrofajlar, yemek ve Aspergillus sporlar öldürmek olduğunu göstermiştir. Ancak, çelişkili resul olmuşturA. büyümesinin kontrolünde makrofajda NADPH oksidaz rolüne olarak ts fumigatus ^{6, 7} sporlar.

Bu yöntemin amacı, bir ev sahibi savunma A'ya karşı aracılık makrofajlarda NADPH oksidazın belirli bir rolü olduğunu tanımlamak için fumigatus sporlar. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus ⁴ sporlar. En yakından inhale mantarlara konak yanıtı modellemek için, uyarılmamış farelerin hemen kurban aşağıdaki bronkoalveoler lavaj ile hasat alveol makrofajlar kullanılır. İzole Alveoler makrofaj kullanımı in vivo Aspergillus'a karşı savunmak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, işe nötrofiller) yokluğunda kendi antifungaldir odaklanmak sağladı. Bu yöntemde, alveolar makrofajlar hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için hasattan önce in vivo olarak boyandı. '/ P>

Bu protokol için diğer bir avantajı, bir GFP-ifade A. kullanılmasıdır fumigatus suşu. Bu mantar hifal aşamasında konidial aşamasından GFP ifade ve daha fazla boyanma ihtiyacı yok. Daha ayrıntılı görüntüler elde etmek için, elde edilen görüntülerin üç boyutlu yapıların yeniden sağlayan konfokal mikroskopi seçti. Üç boyutlu rekonstrüksiyon hif bir makrofaj veya yoluyla çevresinde büyüyen ziyade ayırt yeteneği verir. Konidya ayrıca ekstraselüler karşı hücre içi gibi hassas ayırt edilebilir.

Protokol

Bu çalışmada, hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Roswell Park Kanser Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve federal tüm devlet, uyulması ve Sağlık düzenlemeler National Institutes edildi.

1.. In vivo Makrofaj Etiketleme

Not: PHK26 (iv) intravenöz olarak uygulandığında dolaşımdan ve dokularda hem fagositik hücreler tarafından alınacak bir lipofilik boyadır. PKH26 makrofaj hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için in vivo etiketlenmesi için kullanılmıştır. PKH-26 sabit bir şekilde uzun süreler boyunca alveolar makrofajlar biriken avantajına sahiptir. 10 gün uygulanmasından sonra bekleme PKH26 ^{8, 9} sadece alveolar makrofaj kararlı biçimde ayrılan işaretli dolaşımdan her etiketli hücrelerin temizlenmesi için olanak sağlar. PKH26 uyarma (551 nm) ve emisyon (567 nm) özellikleri uyumlu olan kırmızı florokromla olduğunurodamin veya fikoeritrin algılama sistemleri ile. Herhangi bir etiketleme prosedürü canlılığı kaybı da dahil olmak üzere, paraziti tanıtabilirsiniz. Biz farklı fare genotipleri makrofajların etiketleme için aynı yaklaşım kullanmak Ancak, (örneğin, WT vs NADPH oksidaz eksikliği), bu eserlerin etkileri düzgün olur.

1. PKH26 stok solüsyonu (etanol içinde 1 x 10 ^-3 M) üretici tarafından sağlanan seyreltici C 01:05 sulandırmak.
2. Her bir fare için bir 1/2 ml insülin şırınga (29 G x 1/2 ") ile seyreltilmiş PKH26 yükleyin 100 ul.
3. Hasat için en az 10 gün önce iv enjeksiyonu (kuyruk ven veya retro orbital ya) tarafından farelere yönetmek.

Bronchoalveolar Lavage 2. Hasat Alveoler Makrofajlar (BAL)

Bir deney için kullanılacak farelerin sayısı değişebilir. Bir uyarılmamış fareden tipik bir verim 3-5 x 10 ⁵ alveolar makrofajlar aralığında, ancak bu sayı bas büyük ölçüde değişebilirbu lavaj yapan kişinin fare, deneyim boyutu ve lavaj sıvısı ve akciğer geri çekilen hacim instilasyon sayısı gibi faktörlere ed. Bu protokolde, akciğer yıkama tekrar 1 mi tabi tutulmuş yıkama sıvıları ile birlikte hücre verimini artırmak için yardımcı olan bir kapalı göğüs boşluğu ile gerçekleştirilir.

1. Steril çözelti tutmak için aseptik koşullar kullanılarak avertin anestezik öldürücü bir doz (12.5 mg) intraperitoneal (ip) verilmesi ile fare Euthanize.
2. % 70 etanol ile iyice fare sprey.
3. Göğüs (Şekil 1A) açığa hayvanın kafatası ucundan cilt kaldırmak.
   1. Diyaframın hemen altında deri küçük bir kesim olun.
   2. Kesim içine parmağınızı yerleştirin ve uzak hayvan (Şekil 1A) kranial ucundan cilt çekin.
   3. Boynun ventral tarafı (Şekil 1A) uzanan kafasına hafifçe yukarıya doğru itilir.
4. Göğüs kafesi ile küçük bir delik kestitoraks sağ tarafına akciğerlere söndürülmesi ve ayrıca aşağıdaki adımları sırasında akciğerlerin görüntülenmesine olanak vermek üzere.
5. Trakea bulun ve dikkatle çevresi dokuları uzak teşrih.
   1. Kavisli bir forseps ile tükürük bezleri, sternohyoid kasları ve gırtlak vb çıkarın.
   2. Dikkatle kavisli bir forseps ile kaldırın ve makas ile yatan halkalı kıkırdak yapısını ortaya trakea (adventita) kapsayan ince dokuyu kesip.
6. Trakea içine kateter yerleştirin.
   1. Kavisli bir forseps kullanarak, trakea (dorsal) arkasında bir sütür koyun ve açıklıktan 10 cm uzunluğa çekin.
   2. Krikoid (kıkırdak kalınlaşmış halka) Yukarıdaki başlayarak dikkatlice trakea göğüs kemiğinin arkasında kaybolur nerede durdurma trakea aşağı bir 22 G kateter kılavuz.
   3. Sıkıca oturması için trakea ve kateter çevresinde dikiş kravat. Kateter iğne çıkarılır.
7. 4-yollu valf birleştirin.
   1. DoldurmakBir 6 ml DPBS,% 1 FBS ile şırınga ve Şekil 1B 'de gösterildiği gibi 4-yollu musluk ekleyin.
   2. 4-yollu vana (Şekil 1 B) üzerinde gösterilen konumda bir boş 6 ml şırınga takın.
   3. Kateter 4-yollu musluk (Şekil 1B) açık portu takın. Trakea kateteri çıkarmak için dikkatli olun.
8. Akciğerlerden lavaj sıvısı toplayın.
   Not: Müfettişler dokuya hasar olasılığını en aza indirmek için lavaj sıvısının düşük miktarlar kullanmayı tercih edebilir. Aynı yaklaşım, sürekli olarak, tüm fare gruplarının uygulanabilir önemlidir.
   1. Böylece boş şırınga kapalı musluğu kolunu çevirin ve yavaş yavaş akciğerleri şişirmek için ~ 1 ml DPBS,% 1 FBS enjekte. Adım 2.4 delik kesme yoluyla akciğer enflasyonu gözlemleyin.
   2. Akciğerleri overinflate için değil dikkatli olun.
   3. Tam şırınga kapalı böylece musluğu kolunu açın ve dikkatlice grip çekilme akciğerlerden gelen kimliği.
   4. Akciğerler Adım 1.4 delik kesim aracılığıyla Söndür gözlemleyin. Kateter iyi bir beraberlik almak için biraz ileri veya geri hareket edilmesi gerekebilir. Trakea içinde kateteri tutmak için özel önlem alın.
   5. Tekrar FBS% 1 enjekte ve akciğerlerden çekilmiş olan tüm DPBS'de kadar 2.8.1-2.8.4 5-6x adımları. Not: akciğer sıvısının kurtarma enjekte edilen sıvının% 100 olmayacaktır.
9. 50 ml konik tüp içine lavaj sıvısı ile boş şırınga. Oda sıcaklığında hücrelere tutun.
10. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Pelet dökün. İstenirse bu sitokin analizi için kaydedilebilir.
11. % 10 FBS ile 1-5 ml RPMI 1640 hücreleri tekrar süspansiyon ve menositometrede saymak. Uyarılmamış fare olarak, BAL ile hasat hücrelerin>% 95 sitolojisi ile teyit edilebilir makrofajlar, olması beklenmektedir.

3.. Kültüre ve Hasat Mantar

"> Bu protokolde kullanılan Aspergillusfumigatus kendi yaşam döngüsünün tüm aşamalarında GFP ifade:. Sporlar, germlings ve hif Bu mantar gerginlik Dr Margo Moore, Simon Fraser Üniversitesi, Vancouver, BC, Kanada tarafından sağlandı.

1. Kloramfenikol (0.05 g / L) ve gentamisin (0.5 g / L) ile yatık Sabouraud agar beyin kalp infüzyon (BHI) üzerine, GFP ifade eden bir Aspergillus fumigatus soyu Levha conidia.
2. Gevşek olarak oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca kapatılmış karanlıkta inkübe edin.
3. DPBS içinde% 0.01 Tween 20 içinde 10 ml yıkama eğik Hasat conidia. Hafifçe gevşetmek için stripette ile mantar kazıyın. Verimi artırmak için Eğimli birkaç kez durulayın.
4. 50 ml konik içine 100 mikron hücre süzgecinden konidial süspansiyon geçmektedir.
5. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet conidia.
6. Süspanse 50 ml DPBS'de konidya ve Hemasitometre kullanarak saymak.
7. DPBS ile iki kez yıkanır ve arzu edilen konsantrasyon, seyreltinyon.

4. Mantar Mücadelesi ve Konfokal Mikroskopi

Konak savunmasında makrofaj NADPH oksidaz rolünü araştırmak için, fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol etmek için üç genotip farelerden izole alveoler makrofaj kabiliyeti değerlendirildi. Bu çalışmada kullanılan genotipleri arasında; Doğal olarak meydana gelen mutasyona Ncf1 (Ncf1 olanağına NADPH oksidaz den yoksun bırakarak p47 ^pHOx, fagosit NADPH oksidaz gerekli bir bileşeni) için kodlayan ve 3) Ncf1 * / 1), vahşi tip fareler, 2) Ncf1 / * Mn-farenin * Mn + transjenik farenin NADPH oksidaz aktivitesi monosit / makrofaj nüfus ^{10, 11} içinde yeniden edilmiştir (MN insan CD68 promotörünün kontrolü altında yabani tip Ncf1 barındıran transgeni ifade eder.)

Konfokal mikroskopi en nedeniyle varlığı Bu deneme için uygundurve slaytlarda olmayan fagosite Konidyumların büyüme. Konfokal mikroskop Z-ekseni içinde bireysel uçaklarının görselleştirme için izin ve makrofaj içeride ziyade çevresinde büyüyen mantar arasındaki farklılaşmayı sağlayacak. Tüm konfokal görüntüler 63X immersiyon yağı lens kullanılarak elde edilir. Z-yığınlar 2.5 elektronik zum faktörü ile elde edilir. Z-yığın kalınlığı alanın üst ve alt kısmını için DAPI ve parlak saha görüntüleri kullanılarak belirlenir. Z-yığınlar ~ 1 mikron kalınlığında 14 bireysel dilimleri ile 24 mikron arasında değişmektedir. Makrofaj ölçümü için, 1X elektronik zum tek taramalar genotipi için 10 alanları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bozulmamış makrofajlar, sırasıyla PKH26 ve membran ve çekirdeğin DAPI lekelemesi göre tespit edilmiştir. Konidya FITC ifadesi ve parlak bir alan görüntüye göre belirlenmiştir.

1. Steril lamelleri ve tabak hazırlayın
   1. Bir Biyolojik Güvenlik Kabinesi altında,% 70 etano 22 x 22 mm cam lamelleri emmek5-10 dakika için l.
   2. Steril PBS lamelleri durulayın.
   3. Steril forseps kullanılarak, yumuşak, tek başına steril paketlenmiş 6 oyuklu plakanın her bir alt tek bir lamel yerleştirin.
2. Tohum ~ 1 x 10 ⁶ PKH26 her bir lamel üzerine alveolar RPMI 1640 300 ul içerisinde süspansiyon haline makrofajlar,% 10 FBS etiketli hasat edildi. Tam sayı hasat verimi bağlı olarak değişebilir.
3. Makrofaj gece boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilerek uygun izin verin.
4. Sonraki sabah, yaklaşık 1 x 10 ⁷ GFP-ifade A. eklemek fumigatus conidia 100 ul önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI 1640,% 10 FBS içinde süspanse.
5. % 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör plaka dönün.
6. Hücreler, 4 ° C'de ya da gece boyunca oda sıcaklığında 2 saat arasında, en az sabit olmalıdır Eşit her bir% 2 formaldehit hacmi de (nihai konsantrasyon% 1 formaldehit) ilave edilerek 3, 7 ve 14 saat düzeltme hücre. Için yer plakalarıgece boyunca 4 ° C 'de, erken zaman noktalarında. Son zaman noktasında (14 saat) için, 2 saat boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak.
7. Fiksasyon sonra, yavaşça forseps kullanarak lamelleri kaldırmak ve DPBS'de durulayın.
8. Katlanmış Kimwipe lamel kenarına koyarak fazla sıvıyı çıkarın.
9. Bir cam mikroskop lamı DAPI ile 6 ul floresan montaj orta uygulayın.
10. Slayt üzerinde lamel bir kenarını yatırın ve yavaşça montaj ortama hücre aşağı tarafı bırakın. Orta montaj yayılmış ve lamel altında düz bir tabaka oluşturacak. Lamel basın gerek yoktur.
11. Şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür ve kurumaya bırakın.
12. Mağaza konfokal mikroskopi ile analiz etmek için hazır olana kadar oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) slayt kutu içinde hazırlanan slaytlar.

Sonuçlar

Stimüle edilmemiş farelerden BAL ile alveolar makrofajlar Toplama sitoloji göre bir>% 95 saf bir nüfus neden olur. 3 ve 7 saat (Şekil 2) saat puan fungal büyümenin hipal aşamasını önüne ve genotipler arasında konidia fagositik etkinliğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. Genotipleri doku invazif hipal aşamasına fagosite konidianın geçişi (Şekil 3) inhibe etme yeteneği ile ilgili karşılaştırılabilir burada 14 saat bir zaman noktasıdır. Bozul...

Tartışmalar

Birlikte in vivo fungal okuma ile makrofaj antifungal aktivitenin ex vivo analiz için, bu yaklaşımı kullanarak, daha önce makrofajlarda NADPH oksidaz A'ya karşı savunmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir fumigatus ^4. Izole alveolar makrofaj kullanılması, in vivo olarak Aspergillus karşı savunmak için diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, nötrofiller işe) yokluğunda, mantarlarla mücadele etkinlikleri odaklanma sa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope