공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

요약

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

초록

폐는 숙주 세포가 정기적으로 미생물 및 미생물 제품에 노출되는 인터페이스입니다. 폐포 대 식세포는 흡입 버섯 및 기타 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포 등 면역 세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식하고 다운 스트림 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 활성 산소 중간체 (로아)을 생성 및 호스트 방어에 중요합니다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 ^{- 1 (3),} 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이 연구의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 ^{4 포자.} 여기서, 우리는 마우스의 능력을 평가하는 방법을 서술포식 누룩 곰팡이 포자 (분 생자)의 성장을 제어하기 lveolar 식세포 (AMS). 폐포 대식 세포는 생체 내에서 스테인드 및 10 일 후 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 의해 생쥐에서 격리됩니다. 대 식세포는 유리 커버 슬립에 도금되어, 다음 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 A.을 시드 미가 투스 포자. 지정된 시간에, 세포를 고정 및 포식 포자 그대로 식세포의 수는 공 초점 현미경에 의해 평가된다.

서문

폐포 대 식세포는 흡입 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식 섭취 및 흡입 포자 (분생 포자)의 성장을 제한하고 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 슈퍼 옥사이드 음이온 및 다운 스트림 활성 산소 중간체 (로아)에 산소 분자를 변환합니다. 만성 육아 종성 질환 (CGD)는 심각한 세균 및 곰팡이 감염에 의해 과도한 염증 반응이 특징 NADPH 산화 효소의 유전 질환이다.

NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 ^{- 1 (3),} 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이전 연구는 호중구가 주로 균사의 단계 ^5를 대상으로하는 반면 폐포 대 식세포가 섭취 및 아스 페르 길 루스 포자를 죽이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 충돌 resul가 있었다A.의 성장을 억제하는 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 역할에 같은 TS 미가 투스는 ^{6, 7, 포자.}

이 방법의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스 포자. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 ^{4 포자.} 가장 밀접하게 흡입 곰팡이에 대한 호스트 응답을 모델링하기 위해, 우리는 비자극 마우스에서 바로 희생 다음과 같은 기관지 세척하여 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 모집 호중구)의 부재에 자신의 항진균 활성에 초점을 할 수있었습니다. 이 방법에서는, 폐포 대 식세포가 수확 후 조작의 양을 최소화하기 위해 수확 전에 생체 내에서 염색 하였다.

이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 더 상세한 이미지를 얻으려면, 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에서 동물에 수행 된 모든 절차는 로스웰 파크 암 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 연방의 모든 상태, 준수, 보건 규정의 국립 연구소했다.

1. 생체 내 대 식세포 라벨링

참고 : PHK26은 (IV) 정맥 투여시 혈액 순환 및 조직에 모두 식세포에 의해 흡수 될 친 유성 염료입니다. PKH26는 대식구의 수확 후 조작의 양을 최소화하는 생체 표지에 사용 하였다. PKH-26은 안정적으로 장기간에 걸쳐 폐포 대 식세포의 축적의 장점이 있습니다. 십일 투여 후 기다리는 PKH26 ^{8, 9} 만 폐포 대 식세포 안정적으로 레이블을 떠나 순환의 모든 레이블 세포의 정리를 할 수 있습니다. PKH26는 여기 (551 NM) 및 방출 (567 nm의) 특성 호환이 빨간색 형광 색소입니다로다 민 또는 피코 에리 트린 탐지 시스템과. 모든 라벨 절차는 생존 능력의 손실을 포함, 유물을 소개 할 수있다. 우리는 다른 마우스 유전자형에서 대 식세포의 표시에 대해 동일한 방법을 사용하기 때문에, (예를 들어, WT 대 NADPH 산화 효소 결핍),이 유물의 효과가 균일하다.

1. PKH26의 원액 (에탄올에 1 × 10 ^-3 M) 제조업체에서 제공하는 희석제 C에서 1:5 희석.
2. 각 마우스의 1 / 2 ml의 인슐린 주사기 (29 G x 1 / 2 ")에 희석 PKH26의 부하 100 μL.
3. 수확하기 최소 10 일 전에 정맥 주사 (꼬리 정맥 또는 복고풍 궤도 중 하나)에 의해 마우스로 관리 할 수​​ 있습니다.

폐포 2. 수확 폐포 대 식세포 (BAL)

실험에 사용하는 마우스의 수는 달라질 수있다. 비자극 마우스로부터 전형적인 수율은 3-5 ^× 105 폐포의 대 식세포의 범위이고, 그러나이 숫자는 BAS 크게 달라질 수이러한 세척을 수행하는 사람의 마우스, 경험의 크기 및 세척액과 폐로부터 회수 볼륨 instillations의 수와 같은 요인에 ED. 이 프로토콜에서 폐 세척을 반복 1 ㎖의 lavages와 함께 세포 수율을 향상하는 데 도움이 폐쇄 흉강으로 수행된다.

1. 멸균 용액을 유지하기 위해 무균 조건을 사용 AVERTIN 마취제 치사량 (12.5 mg)을 복강 내 (IP)을 투여하여 마우스를 안락사.
2. 70 % 에탄올로 철저하게 마우스 스프레이.
3. 흉부 (그림 1A)를 노출 동물의 두개골 끝으로부터 피부를 제거합니다.
   1. 다만 다이어프램 아래 피부에 작은 상처를 확인합니다.
   2. 컷에 손가락을 삽입하고 멀리 동물 (그림 1A)의 두개골 끝에서 피부를 잡아 당깁니다.
   3. 목의 복부 측면 (그림 1A)를 확장, 머리에 약간 밀어.
4. 흉곽을 통해 작은 구멍을 잘라흉부의 오른쪽에 폐를 수축하고 또한 다음 단계에서 폐의 시각화를 허용합니다.
5. 기관을 찾아 조심스럽게 주위 조직을 멀리 해부하다.
   1. 곡선 집게로 침샘, sternohyoid 근육과 후두 등을 제거합니다.
   2. 조심스럽게 곡선 집게로 들어 올려 가위로 기본 고리 연골 구조를 드러내기도 (외막)를 덮고있는 얇은 조직을 절개.
6. 기관에 카테터를 삽입합니다.
   1. 곡선 집게를 사용하여 기관 (에 지느러미) 뒤에 봉합을 배치하고 개방을 통해 10 cm 길이를 당깁니다.
   2. 윤상 (연골의 농축 링) 위에 시작하는 것은 신중 기관은 흉골 뒤​​에 사라지는 중지 기관의 아래 22 G 카테터를 안내합니다.
   3. 단단히 아늑한 적합을위한 기관 및 카테터 주위 봉합을 묶어. 카테터에서 바늘을 제거합니다.
7. 4 방향 코크를 조립합니다.
   1. 기입하나 6 ㎖를 DPBS, 1 % FBS 주사기와 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 4 방향 꼭지에 연결합니다.
   2. 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 표시된 위치에 빈 6 ML의 주사기를 연결합니다.
   3. 카테터에 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 열린 포트를 연결합니다. 기관에서 도관을 제거하지 않도록주의하십시오.
8. 폐에서 세척 유체를 수집합니다.
   참고 : 수사는 조직 손상의 가능성을 최소화하기 위해 세척 유체의 하부 볼륨을 사용하도록 선택할 수있다. 그것은 동일한 방식 일관 모든 마우스 그룹에 적용하는 것이 중요하다.
   1. 그래서 빈 주사기가 닫혀 꼭지의 핸들을 돌려 천천히 폐를 팽창시키는 ~ 1 ㎖의 DPBS, 1 % FBS를 주입. 2.4 단계에있는 구멍 컷을 통해 폐의 팽창을 준수하십시오.
   2. 폐를 overinflate하지 않도록주의하십시오.
   3. 전체 주사기를 닫을 수 있도록 마개의 핸들을 돌려 조심스럽게 독감 철회 폐의 ID입니다.
   4. 폐 단계 1.4의 홀 가공을 통해 폐의 관찰합니다. 카테터는 좋은 무승부를 얻기 위해 약간 앞뒤로 이동해야 할 수 있습니다. 기관 내에서 카테터를 유지하기 위해 특별한 예방 조치를 취할.
   5. 반복 FBS 1 %를 주입하고 폐 단종 된 모든 DPBS까지 2.8.1-2.8.4 5 배의 단계를 반복합니다. 참고 : 폐 유체의 복구가 주입 액의 100 %되지 않습니다.
9. 50 ML 원뿔 튜브에 세척 유체 빈 주사기. 상온에서 전지를 보관하십시오.
10. 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 붓는다. 원하는 경우에 사이토 카인 분석을 위해 저장 될 수 있습니다.
11. 10 % FBS와 1 ~ 5 ㎖의 RPMI 1640 세포를 재현 탁하고 혈구를 계산합니다. 비자극 마우스에서는 BAL 의해 수확 된 세포의> 95 %는 세포 검사에 의해 확인 될 수있는 대 식세포가 될 것으로 예상된다.

3. 배양 및 수확 버섯

">이 프로토콜에 사용되는 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의 수명주기의 모든 단계에 걸쳐 GFP를 표현 :. 포자, germlings 및 균사이 곰팡이 균주 박사 마고 무어, 사이먼 프레이저 대학, 버나비, BC, 캐나다에 의해 제공되었다.

1. 클로람페니콜 (0.05 g / L) 및 겐타 마이신 (0.5 g / L)와 기울기 한천 사부로 뇌 심장 주입 (BHI)에 GFP를 표현 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스 균주의 플레이트 생포.
2. 느슨하게 실온에서 7~10일에 덮인 어둠 속에서 품어.
3. DPBS 0.01 % 트윈 20 10 ㎖로 세척 경사에 의해 수확 생포. 살짝 느슨하게 stripette와 곰팡이를 다 쳤어요. 수율을 높이기 위해 경사를 여러 번 씻어.
4. 50 ML 원뿔에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 포자 현탁액을 전달합니다.
5. 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 펠렛의 생포.
6. 을 Resuspend 50 ㎖의 DPBS에서 생포 및 혈구를 사용하여 계산합니다.
7. DPBS로 두 번 세척하고 원하는 집중 한에 희석록해.

4. 곰팡이 도전과 공 초점 현미경

숙주 방어 식세포 NADPH 산화 효소의 역할을 조사하기 위해, 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하기위한 세 가지 유전자형 생쥐로부터 격리 폐포 대 식세포의 능력을 평가 하였다. 이 연구에 사용 된 유전자형은 다음과 같습니다; 자연적으로 발생하는 Ncf1 돌연변이 (Ncf1 그들에게 NADPH 산화 효소의 결핍을 떠나 P47의 ^phox, 식세포의 NADPH 산화 효소의 필수 구성 요소)에 대한 인코딩, 3) Ncf1 * / 1) 야생형 마우스, 2) Ncf1 * / * MN-마우스 * + Mn이 형질 전환 마우스 NADPH 옥시 다제 활성은 단핵구 / 대 식세포 인구 ^{(10, 11)에서} 재구성 된 (MN은 인간 CD68 프로모터의 제어하에 야생형 Ncf1 은닉 유전자를 나타낸다.)

공 초점 현미경은 최고의 인해 존재로이 분석에 적합그리고 슬라이드에 비 포식 분생 포자의 성장. 공 초점 현미경은 Z 축 내 개인 비행기의 시각화를 허용하고, 대식 세포 내부보다는 주위에 성장하는 곰팡이 사이에 차별화를 가능하게 할 것이다. 모든 공 촛점 이미지는 63X 기름 침지 렌즈를 사용하여 획득된다. Z-스택은 2.5의 전자 줌 배율로 획득됩니다. Z-스택의 두께는, 필드의 상단 및 하단을 찾을 DAPI 및 명 시야 이미지를 사용하여 결정된다. Z-스택은 ~ 1 μm의 두께 (14)로부터 개별 조각 24 μm의였다. 대식 세포의 정량, 1X 전자 줌의 단일 스캔은 유전자형 당 10 필드를 수행 하였다. 본래 식세포 각각 PKH26 및 멤브레인과 핵의 DAPI 염색에 근거 확인되었다. 분생 포자는 FITC 표현과 시야 이미지를 기반으로 확인되었다.

1. 불임의 coverslips와 접시를 준비합니다
   1. 생물 안전 캐비닛에서 70 % 에타의 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 흡수5 ~ 10 분 동안 L.
   2. 멸균 PBS에 커버 슬립을 씻어.
   3. 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 멸균 단독으로 포장 된 6 - 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 하나의 커버 슬립을 배치합니다.
2. 씨 ~ 1 × 10 ⁶ PKH26 각 커버 슬립에 폐포 RPMI 1640 300 μL에 현탁 식세포, 10 % FBS를 표시 수확. 정확한 수는 수확 수율에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 대식 세포는 밤새 5 % CO _2와 37 ° C에서 배양하여 부착 할 수 있습니다.
4. 다음 날 아침, ~ 1 × 10 ⁷ GFP - 표현 A.에게 추가 미가 투스의 포자는 100 ㎕의 예열 (37 ℃) RPMI 1640, 10 % FBS에서 일시 중단.
5. 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다.
6. 세포를 4 ℃의 실온에서 하룻밤 2 시간의 최소 고정되어야한다 같은 각각 2 %, 포름 알데히드의 양 아니라 (최종 농도 1 %의 포름 알데히드)을 추가하여 3, 7, 14 시간 수정 세포에서. 장소 플레이트4 ° C 하룻밤에 이른 시점. 최종 시점 (14 시간)의 경우, 실온에서 2 시간 동안 세포를 고정한다.
7. 고정 후, 부드럽게 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 DPBS에 헹군다.
8. 접힌 킴 와이프에 커버 슬립의 가장자리를 배치하여 여분의 액체를 제거합니다.
9. 유리 현미경 슬라이드에 DAPI와 6 μL 형광 설치 매체를 적용합니다.
10. 슬라이드 커버 슬립 중 하나 가장자리를 놓고 부드럽게 장착 매체로 아래로 셀 측에 놓습니다. 매체를 장착하면 확산 커버 슬립 아래도 층을 형성 할 것이다. 커버 슬립에 누를 필요가 없습니다.
11. 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 공기 건조 할 수 있습니다.
12. 상점은 공 초점 현미경으로 분석 할 준비가 될 때까지 실온에서 (빛으로부터 보호) 슬라이드 상자에 슬라이드를 준비했다.

결과

비자극 생쥐에서 BAL에 의해 폐포 대 식세포를 수집하는 것은 세포 검사를 기반으로> 95 % 순수한 인구가 발생합니다. 3과 7 시간 (그림 2) 시점은 곰팡이 성장의 균사 무대 앞에와 유전자형 사이에서 분생 포자의 식세포의 효율성 비교를 할 수 있습니다. 유전자형이 조직 침습 균사 스테이지 포식 분생 포자의 전이 (도 3)를 억제하는 능력에 대하여 비교 될 수있는 14 ?...

토론

함께 생체 진균 챌린지와 대 식세포의 항균 활성의 생체 외 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 이전 식세포의 NADPH 산화 효소는 A. 방어에서 중요한 역할을한다는 것을 입증 미가 투스 ^4. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 호중구 모집)의 부재에서 자신의 항진균 활...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope