Évaluation de l'activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Résumé

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Résumé

Le poumon est une interface où les cellules hôtes sont fréquemment exposés à des microbes et des produits microbiens. Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des champignons et d'autres microbes inhalés. Macrophages et d'autres cellules immunitaires reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance et d'initier des réactions inflammatoires en aval. L'oxydase phagocyte NADPH génère des intermédiaires réactifs de l'oxygène (ROI) et est essentiel pour la défense de l'hôte. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l'hôte médiée par les neutrophiles ^{1 - 3,} l'importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n'est pas bien définie. Le but de cette étude était de définir le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l'hôte contre A. fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores ^4. Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer la capacité des souris unmacrophages lveolar (AMS) pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytés (conidies). Les macrophages alvéolaires sont colorées in vivo et dix jours plus tard isolées à partir de souris par lavage broncho-alvéolaire (BAL). Les macrophages sont étalées sur des lamelles de verre, puis ensemencées avec la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant A. spores fumigatus. À des moments précis, les cellules sont fixées et le nombre de macrophages avec des spores intactes phagocytées est évaluée par microscopie confocale.

Introduction

Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des microbes inhalés. Macrophages reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance, ingèrent et limitent la croissance des spores inhalées (conidies), et d'initier des réactions inflammatoires. La NADPH oxydase phagocytaire convertit l'oxygène moléculaire en anion superoxyde et des intermédiaires réactifs de l'oxygène en aval (ROI). Granulomatose chronique (CGD) est un trouble héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections bactériennes et fongiques graves et par des réactions inflammatoires excessives.

Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l'hôte médiée par les neutrophiles ^{1 - 3,} l'importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n'est pas bien définie. Des études antérieures ont montré que les macrophages alvéolaires ingèrent et tuent les spores d'Aspergillus, alors que les neutrophiles principalement cibler le stade des hyphes ^5. Cependant, il ya eu des résul contradictoirests sur le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages dans le contrôle de la croissance de A. fumigatus spores ^{6, 7.}

Le but de cette méthode était de délimiter le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l'hôte contre A. spores fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores ^4. Pour modéliser le plus à la réponse de l'hôte aux champignons inhalés, nous avons utilisé les macrophages alvéolaires récoltés par lavage broncho-alvéolaire des souris non stimulées immédiatement après le sacrifice. L'utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous a permis de mettre l'accent sur ​​leur activité antifongique en l'absence d'autres cellules du système immunitaire (par exemple, des neutrophiles recrutés) qui défendent contre Aspergillus in vivo. Dans ce procédé, les macrophages alvéolaires ont été colorées in vivo avant la récolte de manière à minimiser la quantité de manipulation post-récolte.

Un autre avantage de ce protocole est l'utilisation d'un A. exprimant la GFP souche fumigatus. Ce champignon exprime la GFP de la scène conidies par le stade des hyphes et n'a pas besoin de plus d'une coloration. Pour obtenir des images avec plus de détails, nous avons choisi la microscopie confocale, qui permet la reconstruction de structures en trois dimensions à partir des images obtenues. Reconstruction tridimensionnelle donne la possibilité de différencier les hyphes croissante autour plutôt que dans ou à travers un macrophage. Conidies peut aussi être précisément distingués comme intracellulaire contre extracellulaire.

Protocole

Toutes les procédures effectuées sur les animaux dans cette étude ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité à Roswell Park Cancer Institute et respectées tout état, fédéral, et les Instituts nationaux de la réglementation de la santé.

1. In vivo des macrophages étiquetage

Remarque: PHK26 est un colorant lipophile qui sera absorbé par les cellules phagocytaires à la fois dans la circulation et dans les tissus lorsqu'ils sont administrés par voie intraveineuse (iv). PKH26 a été utilisé pour le marquage in vivo pour réduire au minimum la quantité de manipulation post-récolte du macrophage. PKH-26 présente l'avantage d'accumuler de manière stable dans les macrophages alvéolaires sur des périodes prolongées. Attendre 10 jours après l'administration permet de liquidation de toutes les cellules marquées de la circulation, ne laissant que macrophages alvéolaires stable marqué par PKH26 ^{8, 9.} PKH26 est un fluorochrome rouge qui a excitation (551 nm) et d'émission (567 nm) des caractéristiques compatiblesavec des systèmes de détection de la rhodamine ou la phycoérythrine. Toute procédure de marquage peut introduire artefact, y compris la perte de viabilité. Cependant, puisque nous utilisons la même approche pour l'étiquetage des macrophages dans les génotypes de souris différentes (par exemple, WT vs la NADPH oxydase déficient), les effets de ces objets seraient uniformes.

1. Diluer la solution mère de PKH26 (1 x 10 ^-3 M dans de l'éthanol) 1:05 dans le diluant C fournie par le fabricant.
2. Charge: 100 ul de dilution PKH26 dans une seringue à insuline de 1/2 ml (29 G x 1/2 ") pour chaque souris.
3. Administrer à des souris par injection intraveineuse (veine de la queue soit ou rétro orbital) au moins 10 jours avant la récolte.

2. Récolte macrophages alvéolaires par lavage broncho-alvéolaire (LBA)

Le nombre de souris à utiliser pour une expérience peut varier. Un rendement typique d'une souris non stimulées est de l'ordre de 3-5 x 10 ⁵ macrophages alvéolaires, mais ce nombre peut varier grandement Based sur des facteurs tels que la taille de la souris, l'expérience de la personne effectuant le lavage, et le nombre d'instillations de fluide de lavage et le volume retiré à partir de poumons. Dans ce protocole lavage pulmonaire est effectuée avec une cavité thoracique fermé qui, avec des lavages répétés 1 ml permet d'augmenter le rendement de la cellule.

1. Euthanize souris par administration d'une dose létale d'anesthésique Avertin (12,5 mg) par voie intrapéritonéale (ip) en utilisant des conditions aseptiques afin de maintenir la solution stérile.
2. Pulvériser la souris à fond avec de l'éthanol 70%.
3. Enlever la peau à partir de l'extrémité crânienne de l'animal à exposer le thorax (figure 1A).
   1. Faire une petite incision dans la peau juste sous le diaphragme.
   2. Insérez un doigt dans la coupe et tirez la peau à partir de l'extrémité crânienne de l'animal (figure 1A).
   3. Appuyez légèrement sur ​​la tête, l'extension de la face ventrale du cou (figure 1A).
4. Découpez un petit trou à travers la cage thoraciquedans la partie droite du thorax pour dégonfler les poumons et également permettre la visualisation des poumons au cours des étapes suivantes.
5. Localiser la trachée, et soigneusement disséquer les tissus environnants.
   1. Retirez les glandes salivaires, les muscles sterno et du larynx, etc avec des pinces courbes.
   2. Soulevez délicatement avec une pince courbes et couper avec des ciseaux le tissu mince recouvrant la trachée (adventice) révélant la structure du cartilage annelé sous-jacent.
6. Insérer un cathéter dans la trachée.
   1. En utilisant des pinces incurvées, placer une suture derrière (dorsal à) la trachée et tirer une longueur de 10 cm à travers l'ouverture.
   2. Commençant au-dessus du cricoïde (l'anneau épaissi de cartilage) guide attentivement un 22 G cathéter dans la trachée d'arrêt où la trachée disparaît derrière le sternum.
   3. Attacher solidement suture autour de la trachée et le cathéter pour un ajustement parfait. Retirer l'aiguille du cathéter.
7. Assembler 4 voies robinet.
   1. Remplirun 6 ml seringue avec du DPBS, 1% de FBS et attachent à 4 voies robinet comme indiqué sur la figure 1B.
   2. Attacher un vide 6 ml seringue à la position indiquée sur la 4 voies robinet (figure 1B).
   3. Fixez port ouvert sur ​​la 4 voies robinet à cathéter (figure 1B). Attention à ne pas déloger le cathéter de la trachée.
8. Recueillir le liquide de lavage des poumons.
   Remarque: Les chercheurs peuvent choisir d'utiliser la baisse des volumes de liquide de lavage pour minimiser la possibilité de dommages aux tissus. Il est important que la même approche soit appliquée de façon uniforme dans tous les groupes de souris.
   1. Tournez la poignée sur le robinet si la seringue vide est fermé et injecter lentement ~ 1 ml DPBS, 1% de FBS pour gonfler les poumons. Observer l'inflation du poumon à travers le trou percé à l'étape 2.4.
   2. Veillez à ne PAS surgonfler les poumons.
   3. Tournez la poignée sur le robinet de sorte que la seringue pleine est fermé, et retirer soigneusement la grippe Identifiant à partir des poumons.
   4. Respecter les poumons se dégonflent à travers le trou découpé dans l'étape 1.4. Le cathéter peut être nécessaire de déplacer légèrement vers l'arrière ou vers l'avant pour obtenir un bon tirage. Prendre des précautions particulières pour maintenir le cathéter dans la trachée.
   5. Répétez les étapes 2.8.1-2.8.4 5-6x jusqu'à ce que tout le DPBS, 1% de FBS a été injecté et retiré les poumons. Remarque: la récupération de liquide pulmonaire ne sera pas 100% de fluide injecté.
9. Seringue vide avec un lavage d'un fluide dans un tube conique de 50 ml. Maintenir les cellules à température ambiante.
10. Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante et verser le surnageant. Ceci peut être sauvegardé pour l'analyse des cytokines, si désiré.
11. Remettre les cellules en 1-5 ml de RPMI 1640 avec 10% de FBS et compter sur un hématimètre. Chez la souris, non stimulé,> 95% des cellules récoltées par BAL sont censés être des macrophages, qui peuvent être confirmés par cytologie.

3. Mise en culture et de récolte du champignon

»> L'Aspergillus fumigatus utilisé dans ce protocole exprime la GFP à tous les stades de son cycle de vie:. Spores et des hyphes, germlings Cette souche fongique a été fourni par le Dr Margo Moore, de l'Université Simon Fraser, Burnaby, BC, Canada.

1. Plate conidies d'une souche d'Aspergillus fumigatus exprimant la GFP sur Sabouraud infusion cœur-cervelle (BHI) avec des pentes de gélose chloramphénicol (0,05 g / L) et de gentamicine (0,5 g / L).
2. Incuber dans l'obscurité bouchée non hermétiquement pendant 7 à 10 jours à température ambiante.
3. Récolte des conidies par lavage oblique avec 10 ml de 0,01% de Tween 20 dans du DPBS. Légèrement gratter le champignon avec le Stripette à desserrer. Rincer la pente à plusieurs reprises pour augmenter le rendement.
4. Passez suspension de conidies par un tamis cellulaire 100 um dans 50 ml conique.
5. Pellet conidies par centrifugation à 400 xg pendant 10 min.
6. Remettre en suspension dans 50 ml conidies DPBS et compte en utilisant un hématimètre.
7. Laver deux fois avec du DPBS et diluer à concentration souhaitéstration.

4. Défi fongique et la microscopie confocale

Pour étudier le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages défense de l'hôte, la capacité de macrophages alvéolaires isolés à partir de souris de trois génotypes pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytés a été évaluée. Les génotypes utilisés dans cette étude sont les suivantes; 1) des souris de type sauvage, 2) Ncf1 * / * Mn-souris avec une mutation Ncf1 d'origine naturelle (Ncf1 code pour ^p47phox, un composant nécessaire du oxydase phagocytaire de NADPH) en leur laissant la NADPH oxydase déficiente, et 3) Ncf1 * / * Mn + souris transgéniques (MN dénote hébergeant le transgène de type sauvage Ncf1 sous le contrôle du promoteur de CD68 humain) où l'activité de la NADPH oxydase a été reconstitué dans la population de monocytes / macrophages ^{10, 11.}

La microscopie confocale est plus adapté pour ce dosage en raison de la présenceet la croissance des conidies non phagocyté sur les glissières. Le microscope confocal permet la visualisation de plans individuels au sein de l'axe Z, et de permettre une différenciation entre un champignon croissant autour plutôt qu'à l'intérieur des macrophages. Toutes les images confocales sont acquises à l'aide d'une lentille 63X à immersion d'huile. Z-piles sont acquises avec un facteur de zoom électronique de 2,5. L'épaisseur d'une pile en Z est déterminée à l'aide du DAPI et les images de champ lumineux pour localiser le haut et le bas du champ. Z-piles allaient du 14 au 24 pm avec des tranches individuelles ~ 1 um d'épaisseur. Pour la quantification des macrophages, des analyses simples de 1X zoom électronique ont été réalisées sur 10 champs par génotype. Macrophages intactes ont été identifiés sur la base de la coloration DAPI PKH26 et de la membrane et le noyau, respectivement. Les conidies ont été identifiés sur la base de l'image de champ lumineux expression FITC et.

1. Préparer des lamelles et des plaques stériles
   1. En vertu d'une enceinte de sécurité biologique, faire tremper 22 x 22 mm lamelles de verre dans 70% ethanol pendant 5-10 min.
   2. Rincer lamelles dans du PBS stérile.
   3. En utilisant des pinces stériles, placer délicatement une seule lamelle dans le fond de chaque puits d'un seul emballé plaque de 6 puits stérile.
2. Graine ~ 1 x 10 ⁶ récolté PKH26 étiqueté macrophages alvéolaires en suspension dans 300 ul de RPMI 1640, FBS à 10% sur chaque lamelle couvre-objet. Le nombre exact peut varier en fonction du rendement de la récolte.
3. Laisser macrophages adhèrent à incuber à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant une nuit.
4. Le lendemain matin, ajouter environ 1 x 10 ⁷ exprimant la GFP A. fumigatus conidies en suspension dans 100 ul préchauffé (37 ° C) du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS.
5. Plaque revenir à 37 ° C incubateur avec 5% de CO _2.
6. Les cellules doivent être fixées pour un minimum de 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. A 3, 7, 14 h et les cellules de correctifs en ajoutant un volume égal de 2% de formaldéhyde dans chaque puits (concentration finale de 1% de formaldehyde). La place de plaques pour lapoints de temps au début à 4 ° C durant la nuit. Pour l'instant final (14 h), fixer les cellules à température ambiante pendant 2 heures.
7. Après fixation, retirez délicatement les lamelles à l'aide des pinces et rincer dans du DPBS.
8. Éliminer le liquide en excès en mettant le bord de la lamelle couvre-objet sur un Kimwipe pliée.
9. Appliquer 6 fluorescence ul de milieu de montage avec DAPI à une lame de microscope en verre.
10. Placer un bord de la lamelle sur la lame et déposer délicatement avec le côté de la cellule vers le bas dans le milieu de montage. Milieu de montage se propage et former une couche uniforme sous la lamelle. Il n'est pas nécessaire d'appuyer sur la lamelle.
11. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher à l'air.
12. Magasin préparé des diapositives dans une boîte de glissement (abri de la lumière) à la température ambiante jusqu'au moment de l'analyse par microscopie confocale.

Résultats

Collecte des macrophages alvéolaires par BAL de souris non stimulés se traduira par une population pure à> 95% sur la base de la cytologie. Le 3 et 7 h (Figure 2) points de temps précèdent le stade des hyphes de la croissance fongique et permettent une comparaison de l'efficacité de phagocytose des conidies chez les génotypes. Le point de temps de 14 h est l'endroit où les génotypes peuvent être comparées en ce qui concerne l'aptitude à inhiber la transition de conidies ...

Discussion

En utilisant cette approche ex vivo pour l'analyse de l'activité antifongique des macrophages avec challenge in vivo fongique, nous avons précédemment montré que la NADPH oxydase dans les macrophages jouent un rôle important dans la défense contre A. fumigatus ^4. L'utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous permet de mettre l'accent sur ​​leur activité antifongique en l'absence d'autres cellules du système immunitaire (par exemple,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope