הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

Summary

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים ^{3 - 1,} את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי ^4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.

Introduction

מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות.

למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים ^{3 - 1,} את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal ^5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א ' fumigatus נבגי ^{6, 7.}

מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי ^4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף.

יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות.

1. בvivo Macrophage תיוג

הערה: PHK26 הוא צבע lipophilic שיינקט על ידי תאי phagocytic גם במחזור וברקמות, כאשר בהזרקה לווריד (IV). PKH26 שימש לסימון in vivo כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר הקטיף של מקרופאג. יש PKH-26 היתרון של יציבות צבירה במקרופאגים מכתשיים לאורך תקופות ממושכות. מחכה 10 ימים לאחר מתן מאפשר סליקה של כל התאים שכותרתו ממחזור ומשאירים רק מכתשיים מקרופאג שכותרתו ביציבות עם PKH26 ^{8, 9.} PKH26 הוא fluorochrome אדום שיש עירור (551 ננומטר) ופליטת מאפיינים (567 ננומטר) תואמיםעם מערכות rhodamine או זיהוי phycoerythrin. כל הליך תיוג יכול להציג את החפץ, לרבות אובדן יכולת הקיום. עם זאת, מאחר שאנו משתמשים באותה הגישה לתיוג של מקרופאגים בגנוטיפים עכבר שונים (למשל, WT לעומת NADPH אוקסידאז לקוי), את ההשפעות של חפצים אלה יהיו אחידות.

1. לדלל פתרון מניות של PKH26 (1 x 10 ^-3 M באתנול) 1:05 ב-C diluent המסופק על ידי יצרן.
2. של PKH26 דילול עומס 100 μl לתוך מזרק 1/2 מיליליטר אינסולין (29 G x 1/2 ") לכל עכבר.
3. לנהל לעכברים בהזרקת IV (או וריד זנב או מסלולית רטרו) 10 ימים לפחות לפני הקציר.

2. קציר מכתשיים המקרופאגים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL)

מספר העכברים לשימוש עבור ניסוי יכול להשתנות. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 ⁵ מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה BASאד בגורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של נוזל שטיפה והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם lavages 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא.

1. להרדים את עכבר על ידי מתן מנה קטלנית של חומר ההרדמה Avertin (12.5 מ"ג) intraperitoneally (IP) באמצעות תנאים אספטיים כדי לשמור על התמיסה סטרילית.
2. ספריי עכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
3. הסר את העור מקצה הגולגולת של בעלי חיים וחושפים את בית החזה (איור 1 א).
   1. לעשות חתך קטן בעור ממש מתחת לסרעפת.
   2. הכנס את האצבע לתוך החתך ולמשוך את עור מקצה הגולגולת של (איור 1 א) לבעלי החיים.
   3. לדחוף את מעט על הראש, המשתרע בצד הגחוני של הצוואר (איור 1 א).
4. לחתוך חור קטן שדרך כלוב הצלעותלצד הימני של בית החזה כדי להוציא את האוויר לריאות וגם לאפשר הדמיה של ריאות במהלך השלבים הבאים.
5. אתר את קנה הנשימה, ובזהירות לנתח משם רקמה שמסביב.
   1. הסר את בלוטות רוק, שרירי sternohyoid וגרון, וכו 'עם מלקחיים מעוקלים.
   2. בזהירות להרים עם מלקחיים מעוקלים ולחתוך עם מספריים הרקמה דקה המכסה את קנה הנשימה (adventitia) לחשוף את מבנה סחוס טבעתי שבבסיס.
6. הכנס קטטר לתוך קנה הנשימה.
   1. באמצעות מלקחיים מעוקלים, הנח תפר מאחור (גב ל) קנה הנשימה ולשלוף אורך 10 סנטימטר דרך הפתח.
   2. החל מעל cricoid (הטבעת המעובה של סחוס) ינחה בזהירות קטטר G 22 המורד קנה הנשימה לעצור בו את קנה הנשימה נעלמת מאחורי עצם החזה.
   3. בתוקף לקשור תפר סביב קנה הנשימה וקטטר להתאמה הדוקה. הסר את המחט מקטטר.
7. להרכיב ברזלים 4 כיוונים.
   1. למלאאחד 6 מיליליטר המזרק עם DPBS, FBS 1% ולצרף לברזלי 4 כיוונים כפי שמצוין באיור 1.
   2. צרף מזרק מיליליטר ריק 6 במיקום מצויינים על ברזלים 4-way (איור 1).
   3. צרף נמל פתוח בברזלים 4-דרך קטטר (איור 1). היזהר שלא לסלק קטטר מקנה הנשימה.
8. לאסוף שטיפת נוזלים מריאות.
   הערה: חוקרים יכולים לבחור להשתמש בכמויות נמוכות יותר של נוזל שטיפה כדי למזער את האפשרות של נזק לרקמות. זה חשוב כי באותה הגישה יש ליישם באופן עקבי בכל קבוצות העכבר.
   1. סובב את הידית על ברזלים כך המזרק הריק סגור ולאט להזריק DPBS ~ 1 מיליליטר, 1% FBS לנפח את הריאות. שים לב לאינפלצית ריאה דרך החור בשלב 2.4.
   2. היזהר שלא overinflate הריאות.
   3. סובב את הידית על ברזלים, כך שהמזרק המלא סגור, ולסגת בזהירות השפעת id מהריאות.
   4. שים לב לריאות להוציא את האוויר דרך החור בשלב 1.4. קטטר ייתכן שיצטרך להזיז מעט אחורה או אחורה כדי לקבל הגרלה טובה. לנקוט אמצעי זהירות מיוחדת כדי לשמור את הקטטר בתוך קנה הנשימה.
   5. חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 5-6x עד שכל DPBS, 1% FBS כבר הזריק ונסוג מהריאות. הערה: התאוששות של ריאות נוזל לא תהיה של נוזל מוזרק 100%.
9. מזרק ריק עם נוזל שטיפה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשמור על תאים בטמפרטורת חדר.
10. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ויוצקים את supernatant. זו ניתן לשמור לניתוח ציטוקינים אם תרצה בכך.
11. Resuspend תאים ב1-5 מיליליטר RPMI 1640 עם FBS 10% ולסמוך על hemocytometer. בעכבר unstimulated,> 95% מתאים שנקטפו על ידי BAL צפויים להיות מקרופאגים, אשר יכול להיות מאושר על ידי ציטולוגיה.

3. Culturing וקציר פטרייה

"> Fumigatus Aspergillus שימוש בפרוטוקול זה מבטא GFP בכל שלבי מחזור החיים שלו:. נבגים, germlings ועובש פטרייתי זן זה הניתן על ידי ד"ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, Burnaby, BC, קנדה.

1. נבגי צלחת של מתח fumigatus Aspergillus להביע GFP בעירוי לב מוח Sabouraud (BHI) אגר שיפועים עם Chloramphenicol (0.05 גר '/ ל') וגנטמיצין (0.5 גר '/ ל').
2. דגירה בחושך כתרים באופן רופף ל7-10 ימים בטמפרטורת חדר.
3. קציר נבגים על ידי אלכסון כביסה עם 10 מיליליטר של 0.01% Tween 20 בDPBS. קל לגרד את הפטרייה עם stripette כדי לשחרר. יש לשטוף את השיפוע מספר פעמים כדי להגדיל את התשואה.
4. עובר השעיה נבגים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ל50 מיליליטר חרוטי.
5. גלולה נבגים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות.
6. נבגי resuspend ב 50 DPBS מיליליטר ולספור באמצעות hemocytometer.
7. שטוף פעמיים עם DPBS ולדלל את ריכוזים רצוייםטיפול במשפחה.

4. פטרייתיים אתגר ומיקרוסקופיה confocal

כדי לחקור את התפקיד של מונואמין NADPH מקרופאג בהגנת מארחת, את היכולת של מקרופאגים מכתשיים מבודדים מעכברים של שלושה גנוטיפים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed הוערכה. גנוטיפים השתמשו במחקר זה כוללים; 1) wild-type עכברים, 2) Ncf1 * / * Mn-עכברים עם מוטציה Ncf1 טבעית (Ncf1 מקודד ^לphox p47, רכיב הנדרש של מונואמין NADPH תא בלען) ומשאיר אותם חסר מונואמין NADPH, ו3) Ncf1 * / * Mn + עכברים הטרנסגניים (MN מציין transgene מחסה wildtype Ncf1 תחת השליטה של אמרגן CD68 אדם) שבו פעילות מונואמין NADPH כבר מחדש באוכלוסיית מונוציטים / מקרופאג ^{10, 11.}

מיקרוסקופיה confocal היא מתאימה ביותר עבור assay זה בשל נוכחותםוצמיחה של נבגים שאינם phagocytosed בשקופיות. מיקרוסקופ confocal יאפשר להדמיה של מטוסים בודדים בתוך ציר ה-Z, ולאפשר הבחנה בין הפטרייה גדלה בסביבה ולא בתוך מקרופאג. כל תמונות confocal נרכשות באמצעות עדשת טבילת שמן 63X. Z-ערימות נרכשות עם גורם הזום אלקטרוני של 2.5. העובי של Z-מחסנית נקבע באמצעות DAPI ותמונות שדה בהירים כדי לאתר את החלק העליון ותחתון של השדה. Z-ערימות נעו 14-24 מיקרומטר עם פרוסות בודדות ~ 1 מיקרומטר עבה. לכימות של מקרופאגים, סריקות יחידה של זום האלקטרוני 1X בוצעו על 10 שדות לכל גנוטיפ. מקרופאגים ללא פגע זוהו מבוסס על PKH26 ומכתים DAPI של הקרום וגרעין בהתאמה. נבגים זוהו מבוסס על ביטוי FITC ותמונת שדה בהיר.

1. הכן את coverslips וצלחות סטרילי
   1. תחת ארון בטיחות ביולוגית, לספוג 22 x 22 coverslips זכוכית מ"מ בethano 70%l ל5-10 דקות.
   2. יש לשטוף coverslips ב PBS סטרילית.
   3. בעזרת מלקחיים סטרילית, מניח בעדינות coverslip יחיד בתחתית היטב בכל צלחת 6 היטב ארוזה בנפרד סטרילי.
2. זרע ~ 1 x 10 ⁶ נקטף PKH26 כותרת מקרופאגים מכתשיים מושעים ב300 μl RPMI 1640, FBS 10% על כל coverslip. המספר המדויק עשוי להשתנות תלוי בתשואת הקציר.
3. לאפשר מקרופאג לדבוק ידי דוגרים על 37 ° C עם 5% CO ₂ בלילה.
4. למחרת בבוקר, להוסיף ~ 1 x 10 ⁷ א-GFP-לבטא נבגי fumigatus מושעים ב100 μl RPMI 1640, 10% FBS (37 מעלות צלזיוס) מחומם מראש.
5. להחזיר את צלחת לאינקובטור 37 ° C עם 5% CO _2.
6. תאים צריכים להיות קבועים למשך התקופה מינימאלית של 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. בבית 3, 7, ו14 תאים לתקן את שעה על ידי הוספת נפח שווה של פורמלדהיד 2% לכל טוב (ריכוז סופי פורמלדהיד 1%). צלחות מקוםנקודות זמן המוקדם ב 4 ° C למשך הלילה. לנקודת הזמן הסופית (14 hr), לתקן את התאים בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
7. לאחר קיבוע, בעדינות להסיר coverslips באמצעות מלקחיים ולשטוף בDPBS.
8. להסיר את הנוזלים עודפים על ידי הצבת קצה coverslip על Kimwipe מקופל.
9. החל 6 הרכבה בינונית הקרינה μl עם DAPI לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ.
10. הנח קצה אחד של coverslip בשקופית ובעדינות שחרר עם צד תא למטה להרכבה בינונית. הרכבה בינונית תתפשט ויוצר שכבה אחידה מתחת coverslip. אין צורך ללחוץ על coverslip.
11. לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור ולאפשר לאוויר יבש.
12. חנות שקופיות מוכנה בקופסא שקופיות (המוגנת מפני אור) בטמפרטורת חדר עד מוכן לנתח על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תוצאות

איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום> 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים ...

Discussion

השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א ⁴ fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope