软琼脂集落形成分析

摘要

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

摘要

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

引言

软琼脂集落形成测定是广泛用于评估体外细胞转化的技术。在历史上，另一个试验中，集落形成试验，通过冰球等人在1956年描述。用于评价细胞形成集落¹的能力。在该技术中，将细胞分散到培养板中，在"进料器"细胞或条件培养基的存在下，以提供必要的生长因子生长。这种技术的局限性是，它仅对于集落形成提供信息。正常细胞是从锚定非依赖性生长抑制，由于特定类型的凋亡性死亡，称为失巢^2。然而，转化细胞有能力生长和分裂，而不结合到基片上。利用这一概念，研究人员开发出了软琼脂克隆形成实验。软琼脂集落形成测定法进行了修改，在最近几年，为解决藻ecific需求。一个变化涉及到荧光染料的掺入，允许高通量菌落计数。另一种变型涉及使用专门的琼脂溶液中，以允许集落形成后检索的活细胞时，需要的蛋白质或DNA样本。

在传统的软琼脂集落形成测定法，细胞生长在一层软琼脂与搁置在软琼脂中，还混有细胞培养基的另外一个层细胞培养基混合的，但含有琼脂的浓度较高。这可以防止细胞粘附到培养板上，还允许转化的细胞形成可见的菌落。该技术背后的基本原理是，正常细胞依赖于细胞外基质接触，以便能够生长和分裂。相反，转化细胞具有生长和分化而不论其周围环境的能力。因此，细胞能够形成菌落在锚地无关的方式为Considered待转化和致癌性。该方法的总体目标是测量在一个半定量的和严格的方式在细胞中这种能力。

Wnt信号通路是在胚胎发育的关键和经常去调节肿瘤发生^3-6。有与Wnt信号相关联的多种途径。规范的途径，通过对转录共激活因子的β-catenin的影响涉及Wnt信号和下游基因的转录调控。 Wnts还通过几个非经典途径的信号，例如，在平面细胞极性通路，它调节参与细胞骨架结构⁷的元素，并且所述的Wnt-钙通路，调节钙的释放从内质网^8。的Wnt配体通过结合型卷曲受体发挥其活性。虽然几个Wnts已被证明在肺癌中上调，WNT7A已显示被下调非SMaL公司通过启动子甲基化⁹升细胞肺癌。 WNT7A结合Fzd9并作为通过非经典途径中的肿瘤抑制基因。的Wnt-7a和FZD-9的恢复抑制非小细胞肺癌细胞¹⁰的生长。 WNT7A / Fzd9的作用是通过ERK-5，这反过来，激活过氧化物酶体增殖物激活受体^{γ（PPARγ）11,12}的激活介导的。在这里，我们表明WNT7A和Fzd9的过度表达导致的小鼠肺癌细胞株的锚定非依赖性生长的抑制。鼠CMT167细胞来自于C57BL / lcrf小鼠¹³个肺腺癌和稳定转染WNT7A和Fzd9。 WNT7A和Fzd9的过表达通过定量PCR（Q-PCR）和WNT7A和Fzd9过表达的功能性被证实是通过PPARγ的下游激活确认。

研究方案

1.准备材料和试剂

1. 标记的组织培养的各孔处理的6孔板适当地对每个细胞系或状况进行调查。
2. 通过将1g粉末介质和0.2g碳酸氢钠在去离子水至50ml的终体积制备2倍的细胞培养基。
3. 通过0.2微米的过滤器进行消毒过此介质。
4. 添加所需的感兴趣的细胞系的正常培养的额外组件。例如，生长在RPMI 1640培养基中补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素溶液的CMT 167细胞系。温暖的培养基至37℃，在热水浴中在使用之前。
5. 另外准备1个细胞培养液中，你会感兴趣的细胞系正常的细胞培养。
6. 制备1％的贵金属琼脂中加入1克贵金属琼脂至100毫升的去离子水中。
   注:带搅拌贵族琼脂不会完全溶解孤单。
7. 准备0.6％贵金属琼脂，加入将0.6克贵金属琼脂至100毫升的去离子水。既琼脂溶液可以在100毫升玻璃瓶闭自如的盖用于长期存储制成。
8. 高压灭菌高贵的琼脂混合消毒。这些混合物可以制成事先并保存于4℃，但应在实验的时间再次加热至琼脂完全溶解。
9. 制备氮蓝四唑氯化物溶液通过制备1mg / ml的储备液中的1×PBS（8克NaCl，0.2克氯化钾，1.44克的Na ₂ HPO _4，及0.24g的KH ₂ PO ₄的H ₂ O操作1000 ml终体积）。这将用于在实验结束时进行染色的菌落。

2.电镀琼脂底层的

1. 松开瓶的1％贵金属琼脂和微波盖约1-2分钟。而加热的微波炉，监控解决方案紧密，以避免沸腾了。继续加热，同时混合间歇直到琼脂完全溶解，溶液澄清。
   注:使用耐热手套加热后处理烧瓶中。如果不这样做可能会造成烧伤或严重伤害。
2. 放置熔化的琼脂溶液和预热的2×培养基中冰桶充满热自来水（42℃）。也放置在50ml锥形管中，在冰桶用热水的管座。转斗细胞培养罩的后续步骤。
3. 对于琼脂的底层，则需要1.5毫升琼脂的混合和中每一个6孔板的孔的。
4. 以确保混合物的足够量，制备总共12毫升每6孔板中。
5. 开始通过加入6毫升培养介质向50ml锥形管中，然后6毫升1％贵金属琼脂溶液中。
6. 倒置的锥形管几次以混合。工作在轻快的步伐将防止软琼脂过早硬化。
7. 制定约5.5毫升混合物到5ml的血清学圆周率佩特。
8. 使气泡上升到移液管塔的顶部以及沉积1.5ml该混合物到每个前。请小心，以避免任何气泡沉积到板孔。
9. 覆盖板并允许琼脂混合物固化在室温下，在细胞培养罩，30分钟。

3.电镀琼脂含细胞的上层

1. 一旦琼脂的下层已经凝固，开始制备上层的。
2. 首先，收获的细胞用胰酶消化并稀释它们1:5的培养基（ 例如，1 ml胰蛋白酶的，加入4毫升培养基）入15ml锥形管中。
3. 计数细胞，并计算出每孔在这个时候制备的最终细胞悬浮液所需要的细胞数量。这个数目将取决于细胞类型而有所不同。使用5000细胞/孔为起点，并根据需要进行调整。对于这个手机号码，您将编写的6667个细胞/ ml的细胞悬液（ 即每个WEL升将接收0.75毫升此悬浮液加入0.75ml琼脂为1.5毫升总体积;细胞的浓度也将1:2稀释为5000的最终总细胞计数）。
4. 每一个6孔板的所需要的细胞悬浮液的体积将再次为1.5毫升制备额外的细胞悬浮液共计每6孔板12毫升
5. 熔体在微波如上0.6％琼脂溶液中，并放入冰桶含热水连同50ml锥形管中的管保持器和来自步骤3.3的最终细胞悬浮液。
6. 转让融化的0.6％琼脂细胞培养罩的后续步骤的冰桶。
7. 混合0.6％的琼脂和细胞悬浮液以1:1的比例，制备12毫升每6孔板的总体积。 1.5毫升将被要求每孔加，但应作出以上。
8. 吸管6毫升细胞悬浮到50ml锥形管中。
9. 然后，添加6毫升0.6％琼脂的在管。
   注:该混合物的温度必须保持在42℃，以避免过早硬化，并最大限度细胞的存活。
10. 工作迅速，吸这种混合物2-3倍分发细胞，然后制定5.5毫升混合成5毫升血清吸管。
11. 允许任何气泡上升到移液管塔的顶部以及沉积1.5ml该混合物到每个前。请小心，以避免任何气泡沉积到板孔。
12. 允许细胞/琼脂混合物放置到37℃的湿润的细胞培养箱中之前，在室温下固化，在细胞培养罩，30分钟。
13. 所需的足够的集落形成的时间而变化的每个细胞系，通常约21天。
14. 应维持在琼脂上以防止干燥的上层培养基中的层。将100μl加入每周两次培养基足以用于此目的。

4.染色板和菌落计数

1. 染色的细胞中加入200 _6;微升每孔并过夜孵育板在37℃，氮蓝四唑氯化物溶液。
2. 一旦菌落染色，采取使用成像井的照片，并使用计数图像分析软件的殖民地。

结果

如由我们的软琼脂集落形成测定WNT7A和Fzd9在CMT167细胞中的表达是有效的肿瘤抑制。预先，我们用Q-PCR表明，WNT7A和Fzd9 mRNA的表达在低的水平在CMT167细胞。 CMT167细胞表现出内源性WNT7A和Fzd9水平低时相比，MLE-12细胞中，SV40转化的小鼠肺上皮细胞系（ 图1）。然后，我们转CMT167细胞2的逆转录病毒表达载体表达WNT7A（LNCX-WNT7A）和Fzd9（LPCX-Fzd9）的人构建体来创建表示既WNT7A和Fzd9（CMT LL WNT7A / Fzd9...

讨论

中的信号蛋白的肿瘤抑制功能的体外确认是困难的。一个可用来调查该属性的最严格的测定法是软琼脂集落形成测定。这里，我们已经说明了利用鼠肺癌细胞稳定过表达WNT7A和Fzd9相比其亲CMT167细胞系的软琼脂集落形成测定。

有考虑有关软琼脂法的几个要点。在此测定法中最关键的步骤是电镀的细胞。细胞计数必须是准确的，并将琼脂溶液不能是太热了。如果没?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket