Assay גיבוש רך אגר המושבה

Summary

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Abstract

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduction

Assay יצירת מושבות אגר הרך הוא טכניקה המשמשת באופן נרחב על מנת להעריך שינוי סלולארי במבחנה. מבחינה הסטורית, assay אחר, assay clonogenic, שתואר על ידי אל פאק et. בשנת 1956 היה בשימוש כדי להעריך את יכולתם של תאים ליצור מושבות ^1. בטכניקה זו, תאים היו מפוזרים על פני צלחת תרבות וגדלו בנוכחותם של תאים 'מזין' או בינוני מותנים לספק גורמי גדילה הכרחיים. המגבלה של שיטה זו הייתה שזה רק סיפק מידע בנוגע להקמת מושבה. תאים נורמלים מנועים מצמיחת מעגן-עצמאי, בשל סוג מסוים של מוות אפופטוטי, נקרא anoikis ^2. עם זאת, יש לי תאים הפכו את היכולת גדלה ומתחלק ללא כריכה למצע. כדי לנצל את המושג הזה, חוקרים פיתחו assay יצירת מושבות אגר הרך. Assay יצירת מושבות אגר הרך מאז השתנה, בשנים האחרונות יותר, כדי לטפל בspצרכי ecific. וריאציה אחת כרוכה שילוב של צבע fluorometric כדי לאפשר ספירת מושבה תפוקה גבוהה. וריאציה נוספת כרוכה בשימוש בפתרון אגר מיוחד כדי לאפשר שליפה של תאי קיימא לאחר הקמת מושבה, כאשר יש צורך בדגימות חלבון או DNA.

ב assay אגר הרך המסורתי הקמת מושבה, תאים גדלים בשכבה אגר רך מעורבב עם מדיום תרבות תא הנשען על שכבה נוספת של אגר רך, גם מעורבב עם מדיום תרבות תא, אך המכילים ריכוז גבוה יותר של אגר. זה מונע מתאים מהקפדה על צלחת התרבות, עדיין מאפשר להפוך תאים ליצור מושבות גלויות. הרציונל מאחורי שיטה זו הוא שתאים נורמלים תלויים בתא למגע מטריצת חוץ-תאי כדי להיות מסוגל לגדול ולהתחלק. לעומת זאת, תאים הפכו את היכולת לגדול ולחלק בלי קשר לסביבתם. לכן, תאים מסוגלים ליצור מושבות באופן מעגן-עצמאי היו גonsidered להשתנות ומסרטן. המטרה הכללית של שיטה זו היא למדוד את היכולת הזו בתאים באופן חצי כמותית ומחמירה.

מסלול איתות Wnt הוא קריטי בהתפתחות עוברת ולעתים קרובות דה-מוסדר ביצירת הגידולים ^3-6. יש מגוון רחב של מסלולים הקשורים לאיתות של Wnt. המסלול הקנונית כרוך איתות ורגולציה של שעתוק הגנים במורד הזרם Wnt דרך השפעתו על בטא-קטנין coactivator תעתיק. Wnts גם אות דרך כמה מסלולים הלא קנוניה, למשל, מסלול מישורי קוטביות תא, המסדיר גורמים מעורבים במבנה cytoskeletal ^7, ומסלול ה- Wnt-סידן, המסדיר שחרור סידן מreticulum endoplasmic ^8. הליגנדים Wnt להפעיל את פעילותם דרך קשירת הקולטנים מסולסלים. למרות שמספר Wnts הוכח להיות שהוגברה בסרטן הריאות, Wnt7a הוכח להיות למטה מוסדר שבאינו smalסרטן הריאות של תאי l דרך אמרגן מתילציה ^9. Wnt7a נקשר Fzd9 ופועל כמדכא סרטן דרך מסלול הלא קנוניות. שיקום של Wnt-7 א וFzd-9 מעכב את הצמיחה של תאי סרטן הריאות של תאים הלא-קטנים ^10. ההשפעות של Wnt7a / Fzd9 מתווכות באמצעות ההפעלה של ERK-5, אשר בתורו, מפעיל γ קולט מופעל proliferator peroxisome (PPARγ) ^11,12. כאן, אנו מראים כי ביטוי יתר של Wnt7a וFzd9 תוצאות בדיכוי צמיחת מעגן-עצמאי של שורת תאי סרטן הריאות עכברית. תאי CMT167 עכבריים נגזרו מסרטן ריאות בC57BL / עכברי lcrf ¹³ והיו transfected ביציבות עם Wnt7A וFzd9. ביטוי יתר של Wnt7A וFzd9 אושרו על ידי כמותיים-PCR (Q-PCR) ואת הפונקציונליות של ביטוי יתר Wnt7A וFzd9 אושר באמצעות הפעלת זרם של PPARγ.

Protocol

1. הכנת חומרים וריאגנטים

1. תווית היטב בכל תרבית רקמה שטופלה צלחת 6-היטב כראוי עבור כל שורת תאים או מצב הנחקר.
2. להכין מדיום תרבות תא 2x ידי המסת 1 גרם של אבקה ובינונית 0.2 גרם של סודה לשתייה במי דה המיונן לנפח סופי של 50 מיליליטר.
3. עובר מדיום זה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לעקר.
4. הוספת רכיבים נוספים שנדרשו לתרבות הנורמלית של הקו הסלולרי של עניין. לדוגמא, לגדול קו 167 תא CMT ב1640 בינוני RPMI השלים עם FBS 10% לבין 1% פניצילין / סטרפטומיצין פתרון. מדיום חם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים לפני השימוש.
5. להכין מדיום תרבית תאי 1x בנפרד כפי שהיית לתרבות תא נורמלית של הקו הסלולרי של עניין.
6. הכן 1% אגר אציל על ידי הוספת 1 גרם של אגר לאצילי 100 מיליליטר של מים ללא יונים.
   הערה: אגר נובל לא להתמוסס לחלוטין עם תסיסה לבד.
7. הכן0.6% אציליים אגר על ידי הוספת 0.6 גרם של אצילי אגר למי דה מיונן 100 מיליליטר. שני פתרונות אגר יכולים להתבצע ב100 בקבוקי זכוכית מיליליטר עם מכסי closable לאחסון לטווח ארוך.
8. החיטוי התערובות אגר אציליות לעקר. תערובות אלה יכולות להתבצע מראש ולאחסן 4 ° C, אבל צריך להיות מחוממת שוב בזמן הניסוי עד אגר נמס לגמרי.
9. הכן פתרון כלוריד tetrazolium nitroblue על ידי הפיכת 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות ב1x PBS (8 גרמו NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 g Na _{2 4} HPO, ו0.24 g KH ₂ PO ₄ בH ₂ O לנפח של 1,000 מיליליטר ). זה ישמש בסופו של הניסוי להכתים את המושבות.

2. ציפוי של שכבה התחתונה של אגר

1. שחרר את המכסה שעל הבקבוק של 1% אגר ומיקרוגל אציליים כ 1-2 דקות. בחימום במיקרוגל, לפקח על הפתרון בשיתוף פעולה הדוק כדי למנוע רותח מעל. המשך חימום, תוך ערבוב מדי פעם,עד אגר נמס לחלוטין הפתרון הוא ברור.
   הערה: השתמש בכפפות עמידה בחום לטפל בקבוק לאחר חימום. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לכוויות או לפציעה חמורה.
2. הנח פתרון נמס אגר ובינוני תרבות 2x מחוממת מראש בדלי קרח מלא במים חמים ברז (42 מעלות צלזיוס). גם למקם את צינור חרוטי 50 מיליליטר בבעל צינור בדלי הקרח עם מים חמים. העבר את הדלי למכסת מנוע תרבית תאים על הצעדים הבאים.
3. לשכבה התחתונה של אגר, תצטרך 1.5 מיליליטר של תערובת של אגר ובינוני לכל טוב של צלחת 6-היטב.
4. כדי להבטיח כמות מספקת של התערובת, להכין כולל של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב.
5. התחל על ידי הוספת 6 מיליליטר של מדיום תרבות צינור חרוטי 50 מיליליטר ולאחר מכן 6 מיליליטר של הפתרון אגר אצילי 1%.
6. להפוך את צינור חרוטי כמה פעמים כדי לערבב. עבודה בקצב מהיר תמנע את התקשות מוקדמת של אגר הרך.
7. צייר את כ 5.5 מיליליטר של תערובת לתוך pi סרולוגיות 5 מיליליטרpette.
8. לאפשר בועות האוויר לעלות לחלק העליון של עמודת פיפטה לפני הפקדת 1.5 מיליליטר של תערובת זו לתוך כל טוב. השתמש בזהירות כדי להימנע מתצהיר של כל בועות אוויר לתוך בארות הצלחת.
9. מכסה את הצלחות ולאפשר תערובת אגר לבסס בטמפרטורת חדר, במכסת מנוע תרבית תאים, למשך 30 דקות.

3. ציפוי השכבה העליונה של תאים המכילים אגר

1. ברגע שהשכבה התחתונה של אגר יש הקרושה, להתחיל בהכנה של השכבה העליונה.
2. ראשית, תאי קציר על ידי trypsinization ולדלל אותם 1: 5 במדיום התרבות (לדוגמא עבור 1 מיליליטר של טריפסין, להוסיף 4 מיליליטר של מדיום) לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר.
3. ספירת תאים ולחשב את מספר התאים הדרושים לכל טוב להכין השעיה תא סופית בשלב זה. מספר זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג תא. השתמש 5,000 תאים / היטב כנקודת התחלה ולהתאים לפי צורך. מספר תא זה, היית להכין השעיה תא של 6667 תאים / מיליליטר (כלומר כל well יקבל 0.75 מיליליטר של השעיה זו ו0.75 מיליליטר של אגר להיקף כולל של 1.5 מיליליטר; הריכוז של תאים יהיה גם בדילול 1: 2 לספירה סופית כוללת תא של 5,000).
4. הנפח של ההשעיה תא הדרושה לכל טוב של צלחת 6-היטב שוב יהיה 1.5 מיליליטר. הכן השעיה תא נוספת בהיקף של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב.
5. ממסים 0.6% פתרון אגר במיקרוגל כאמור לעיל ואת המקום לתוך דלי קרח המכיל מים חמים יחד עם צינור 50 מיליליטר חרוטי בבעל צינור והשעית התא הסופי משלב 3.3.
6. העבר את דלי הקרח עם אגר 0.6% מומסים למכסת מנוע תרבית תאים על הצעדים הבאים.
7. לערבב אגר 0.6% והשעית תא 1: 1, הכנה בנפח כולל של 12 מיליליטר לכל צלחת 6-היטב. 1.5 מיליליטר יידרש לכל טוב, אבל נוסף צריכים להיעשות כאמור לעיל.
8. פיפטה 6 מיליליטר של השעיה תא לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
9. לאחר מכן, להוסיף 6 מיליליטר של אגר 0.6% לצינור.
   הערה: הטמפרטורה של תערובת זו צריכה להיותהמשיך סביב 42 מעלות צלזיוס, כדי למנוע התקשות מוקדמת ועל מנת למקסם את הישרדות תא.
10. העבודה במהירות, פיפטה תערובת זו 2-3x להפיץ תאים, ולאחר מכן לצייר את 5.5 מיליליטר של תערובת לתוך פיפטה סרולוגית 5 מיליליטר.
11. לאפשר לכל בועות אוויר לעלות לחלק העליון של עמודת פיפטה לפני הפקדת 1.5 מיליליטר של תערובת זו לתוך כל טוב. השתמש בזהירות כדי להימנע מתצהיר של כל בועות אוויר לתוך בארות הצלחת.
12. לאפשר תערובת תא / אגר לבסס בטמפרטורת חדר, במכסת מנוע תרבית תאים, למשך 30 דקות לפני הנחת לתוך תרבית תאי חממת humidified 37 ° C.
13. הזמן הנדרש להקמת מושבה נאותה משתנה עבור כל קו תא, בדרך כלל סביב 21 ימים.
14. שכבה של מדיום גידול יש לשמור על השכבה העליונה של אגר כדי למנוע התייבשות. של מדיום הוסיף פעמיים בשבוע 100 μl מספיק למטרה זו.

4. מושבות מכתימות את צלחות וספירה

1. תאי כתם על ידי הוספת 200 _6; l של פתרון כלוריד tetrazolium nitroblue לכל טוב ודוגרי צלחות לילה בשעה 37 ° C.
2. ברגע שמושבות מוכתמות, לצלם בארות באמצעות תרמי ולספור מושבות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

תוצאות

הביטוי של Wnt7A וFzd9 בCMT167 תאים יעיל בדיכוי גידול כפי שמודגם על ידי assay אגר הרך שלנו הקמת מושבה. באופן ראשוני, היינו Q-PCR כדי להראות שWnt7A וFzd9 mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות בCMT167 תאים. תאי CMT167 הראו רמות נמוכות של Wnt7A אנדוגני וFzd9 בהשוואה לMLE-12 תאים, תא קו-שינה SV40 עכברי אפיתל הריא?...

Discussion

באישור מבחנה של פונקציה מדכאת גידול של חלבוני איתות קשה. אחד מהמבחנים הקפדניים ביותר העומדים לרשות לחקור נכס זה הוא assay יצירת מושבות אגר הרך. הנה, יש לנו מאויר assay היווצרות מושבה הרך אגר באמצעות שורת תאי סרטן הריאות עכברית ביציבות ביתר Wnt7a וFzd9 בהשוואה לשורת תאי CMT16...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket