La formation de dosage souple Agar Colony

Résumé

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Résumé

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduction

Le dosage de formation de colonies sur gélose molle est une technique largement utilisée pour évaluer la transformation cellulaire in vitro. Historiquement, un autre test, le test clonogénique, décrit par Puck et al., En 1956, a été utilisé pour évaluer la capacité des cellules à former des colonies ^1. Dans cette technique, les cellules ont été dispersées sur une plaque de culture et cultivées en présence de cellules nourricières »ou« milieu conditionné pour fournir des facteurs de croissance nécessaires. La limitation de cette technique est qu'elle ne fourni des informations concernant la formation de colonies. Les cellules normales sont empêchés de croissance indépendante de l'ancrage, en raison d'un type particulier de la mort par apoptose, appelé anoïkis ^2. Toutefois, les cellules transformées ont la capacité de croître et de se diviser sans se lier à un substrat. Pour capitaliser sur ce concept, les chercheurs ont développé le test de formation de colonies sur gélose molle. Le test de formation de colonies sur gélose molle a depuis été modifié, au cours des dernières années, pour répondre specific besoins. Une variante consiste incorporation de colorant fluorimétrique pour permettre à haut débit comptage de colonies. Une autre variante consiste à utiliser une solution d'agar spécialisé pour permettre la récupération de cellules viables après la formation de colonies lorsque les échantillons de protéines ou d'ADN sont nécessaires.

Dans le dosage souple classique de formation de colonies agar, les cellules sont cultivées dans une couche d'agar mou mélangé avec un milieu de culture cellulaire qui repose sur une couche de gélose molle, également mélangée avec du milieu de culture de cellules, mais contenant une concentration plus élevée de la gélose. Cela empêche les cellules d'adhérer à la plaque de culture, tout en permettant aux cellules transformées de former des colonies visibles. La raison de cette technique est que les cellules normales de la cellule dépendent de la matrice extracellulaire de contact pour être en mesure de croître et de se diviser. A l'inverse, les cellules transformées sont capables de croître et de se diviser sans tenir compte de leur environnement. Par conséquent, des cellules capables de former des colonies d'une manière indépendante de l'ancrage sont considered à transformer et cancérigènes. L'objectif global de cette méthode est de mesurer cette capacité dans les cellules d'une manière semi-quantitative et rigoureuse.

La voie de signalisation Wnt est critique dans l'embryogenèse et souvent dérégulé dans la tumorigenèse ^6.3. Il existe de multiples voies impliquant la signalisation Wnt. La voie canonique implique la signalisation Wnt et régulation de la transcription du gène en aval par ses effets sur la co-activateur transcriptionnel beta-caténine. Le signal Wnt également à travers plusieurs voies non canoniques, par exemple, la voie plane de la polarité cellulaire, qui régule des éléments participant à la structure du cytosquelette ^7, et la voie Wnt-calcium, qui régule la libération de calcium à partir du reticulum endoplasmique ^8. Ligands Wnt exercent leur activité grâce à des récepteurs Frizzled contraignant. Bien que plusieurs Wnt ont été montré pour être régulés à la hausse dans le cancer du poumon, Wnt7a a été montré pour être régulé à la baisse en non-Smalle cancer du poumon de cellules L à travers la méthylation du promoteur ^9. Wnt7a lie Fzd9 et agit comme un suppresseur de tumeur par l'intermédiaire d'une voie non-canonique. La restauration de Wnt-7a et FZD-9 inhibe la croissance de non-petites cellules du cancer du poumon à grandes cellules ^10. Les effets de Wnt7a / Fzd9 sont médiés par l'activation de ERK-5, ce qui, à son tour, active peroxisome γ du récepteur activé par les proliférateurs de (PPARy) ^11,12. Ici, nous montrons que la surexpression de Wnt7a Fzd9 et se traduit par la suppression de la croissance indépendante de l'ancrage d'une lignée de cellules de carcinome pulmonaire murin. Cellules CMT167 murins ont été dérivées d'un carcinome du poumon chez les souris C57BL / souris LCRF ¹³ et ont été transfectées de manière stable avec Wnt7a et Fzd9. La surexpression de Wnt7a Fzd9 et ont été confirmés par PCR quantitative (Q-PCR) et la fonctionnalité de Wnt7a et Fzd9 surexpression a été confirmé par l'activation en aval de PPARy.

Protocole

1. Préparation des matériaux et réactifs

1. Étiqueter chaque puits d'une culture de tissu traité plaque de 6 puits appropriée pour chaque ligne ou état cellule objet d'une enquête.
2. Préparer 2x milieu de culture cellulaire en dissolvant 1 g de produit de poudre et 0,2 g de bicarbonate de sodium dans de l'eau désionisée à un volume final de 50 ml.
3. Passer ce milieu à travers un filtre de 0,2 pm pour stériliser.
4. Ajouter des composants supplémentaires nécessaires pour la culture normale de la lignée cellulaire d'intérêt. Par exemple, la ligne 167 CMT croître des cellules dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et de la pénicilline / streptomycine solution à 1%. Milieu chaud à 37 ° C dans un bain d'eau chaude avant de les utiliser.
5. Préparer 1x milieu de culture cellulaire séparément comme vous le feriez pour la culture cellulaire normale de la lignée cellulaire d'intérêt.
6. Préparer la gélose noble à 1% par addition de 1 g de gélose noble à 100 ml d'eau désionisée.
   REMARQUE: agar Noble ne se dissout pas complètement avec agitation seul.
7. Préparer0,6% d'agar noble en ajoutant 0,6 g de gélose noble à 100 ml d'eau désionisée. Les deux solutions d'agar peuvent être réalisées dans des bouteilles de 100 ml en verre avec des couvercles pouvant être fermés pour le stockage à long terme.
8. Autoclave les mélanges agar nobles à stériliser. Ces mélanges peuvent être effectués à l'avance et stockées à 4 ° C, mais doivent être chauffées à nouveau au moment de l'expérience jusqu'à dissolution complète de l'agar.
9. Préparer une solution de chlorure de tétrazolium nitrobleu en faisant un / ml de solution mère à 1 mg dans 1 x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO ₄ et 0,24 g de KH ₂ PO ₄ dans H ₂ O à un volume final de 1000 ml ). Elle sera utilisée à la fin de l'expérience pour colorer les colonies.

2. Dépôt de couche de fond de Agar

1. Desserrer le bouchon sur la bouteille de 1% d'agar noble et micro-ondes pendant environ 1-2 min. Tout en chauffant dans un four micro-ondes, surveiller étroitement la solution pour éviter de déborder. Continuer à chauffer, tout en mélangeant de façon intermittente,jusqu'à ce que l'agar soit complètement dissous et la solution est claire.
   REMARQUE: Utiliser des gants résistant à la chaleur pour traiter ballon après le chauffage. Ne pas le faire peut causer des brûlures ou des blessures graves.
2. Placez solution d'agar fondu et milieu de culture 2x préchauffé dans un seau à glace rempli avec de l'eau chaude du robinet (42 ° C). Également placer un tube conique de 50 ml dans un support de tube dans le seau à glace avec de l'eau chaude. Transfert seau à la culture cellulaire capot pour les étapes suivantes.
3. Pour la couche inférieure de l'agar, vous aurez besoin de 1,5 ml d'un mélange d'agar et milieu par puits d'une plaque à 6 puits.
4. Afin d'assurer une quantité suffisante du mélange, préparer un total de 12 ml pour chaque plaque de 6 puits.
5. Lancer en ajoutant 6 ml de milieu de culture à 50 ml le tube conique et ensuite 6 ml de la solution de gélose noble à 1%.
6. Inverser le tube conique plusieurs fois pour mélanger. Travailler à un rythme soutenu permettra d'éviter un durcissement prématuré de la gélose molle.
7. Dresser environ 5,5 ml de mélange dans un 5 ml pi sérologiquepipette.
8. Laissez les bulles d'air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d'air dans les puits de la plaque.
9. Couvrir les plaques et laisser reposer le mélange de la gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d'aération, pendant 30 min.

3. Dépôt de la couche supérieure de gélose cellules contenant

1. Une fois que la couche inférieure de la gélose est solidifiée, commencer la préparation de la couche supérieure.
2. Tout d'abord, les cellules de récolte par traitement à la trypsine et les diluent 1: 5 dans un milieu de culture (par exemple, pour 1 ml de trypsine, ajouter 4 ml de milieu) dans un tube conique de 15 ml.
3. Compter les cellules et calculer le nombre de cellules par puits nécessaires pour préparer une suspension de cellules finale à ce stade. Ce nombre peut varier en fonction du type de cellule. Utilisez 5.000 cellules / puits comme un point de départ et ajuster si nécessaire. Pour ce numéro de cellule, vous préparer une suspension cellulaire de 6667 cellules / ml (soit chaque well recevra 0,75 ml de cette suspension et 0,75 ml de gélose pour un volume total de 1,5 ml; la concentration de cellules est également dilué à 1: 2 pour un nombre total de cellules finale de 5000).
4. Le volume de suspension cellulaire nécessaire par puits d'une plaque à 6 puits sera à nouveau 1,5 ml. Préparer supplémentaire suspension cellulaire total de 12 ml par plaque de 6 puits.
5. Faire fondre solution de gélose à 0,6% dans un four micro-ondes comme ci-dessus et le placer dans un seau à glace contenant de l'eau chaude avec un tube conique de 50 ml dans un support de tube et la suspension de cellules finale de l'étape 3.3.
6. Transférer le seau à glace avec 0,6% de gélose fondue de hotte de culture cellulaire pour les étapes ultérieures.
7. Mélanger 0,6% d'agar et de la suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1, la préparation d'un volume total de 12 ml par plaque à 6 puits. 1,5 ml seront nécessaires pour bien mais en plus doivent être faites comme ci-dessus.
8. Pipette 6 ml de suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml.
9. Ensuite, ajouter 6 ml d'agar à 0,6% dans le tube.
   REMARQUE: La température de ce mélange doit êtremaintenu autour de 42 ° C pour éviter un durcissement prématuré et à maximiser la survie des cellules.
10. En travaillant rapidement, pipette ce mélange 2-3x à distribuer des cellules, puis dessinez une hausse de 5,5 ml de mélange dans une pipette de 5 ml sérologique.
11. Autoriser les bulles d'air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d'air dans les puits de la plaque.
12. Laisser le mélange de cellules / gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d'aération, pendant 30 minutes avant de les placer dans un 37 ° C culture cellulaire incubateur humidifié.
13. Le temps nécessaire à la formation de colonies adéquate varie pour chaque lignée cellulaire, typiquement environ 21 jours.
14. Une couche de milieu de croissance doit être maintenue au-dessus de la couche supérieure de gélose pour éviter la dessiccation. 100 pi de milieu ajoutée deux fois par semaine est suffisant à cet effet.

4. la coloration des plaques et comptage des colonies

1. cellules de tache en ajoutant 200 _6, l d'une solution de chlorure de nitrobleu de tétrazolium par puits et en incubant les plaques pendant une nuit à 37 ° C.
2. Une fois que les colonies sont colorées, prendre des photographies des puits à l'aide d'un imageur et compter les colonies en utilisant un logiciel d'analyse d'images.

Résultats

L'expression de Wnt7a et Fzd9 dans CMT167 cellules est efficace dans la suppression des tumeurs, comme illustré par notre essai de formation de colonies sur gélose molle. Préalablement, nous avons utilisé Q-PCR pour montrer que WNT7A et Fzd9 ARNm sont exprimés dans de faibles niveaux dans CMT167 cellules. CMT167 cellules ont montré de faibles niveaux de Wnt7a endogène et Fzd9 par rapport aux cellules MLE-12, une lignée de cellules épithéliales pulmonaires murines transformées par SV40 (figure 1).<...

Discussion

En confirmation in vitro de la fonction de suppresseur de tumeur de protéines de signalisation est difficile. L'un des tests les plus rigoureux disponibles pour enquêter sur cette propriété est le dosage de formation de colonies sur gélose molle. Ici, nous avons représenté le dosage de formation de colonies sur gélose molle en utilisant une lignée cellulaire de carcinome du poumon de souris surexprimant de manière stable et Wnt7a Fzd9 par rapport à sa lignée cellulaire parentale CMT167....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket