Il saggio Formazione morbida Agar Colony

Riepilogo

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Abstract

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduzione

L'agar morbido dosaggio formazione di colonie è una tecnica largamente usata per valutare trasformazione cellulare in vitro. Storicamente, un kit, la clonogenica, descritto da Puck et al. Nel 1956 è stato utilizzato per valutare la capacità delle cellule di formare colonie ^1. In questa tecnica, le cellule sono state disperse su una piastra di coltura e coltivate in presenza di cellule feeder o terreno condizionato per fornire fattori di crescita necessari. Il limite di questa tecnica è che è fornito solo informazioni riguardanti la formazione di colonie. Le cellule normali viene impedito di crescita ancoraggio-indipendente, a causa di un particolare tipo di morte apoptotica, chiamato anoikis ^2. Tuttavia, cellule trasformate sono in grado di crescere e dividersi senza legarsi ad un substrato. Per capitalizzare questo concetto, i ricercatori hanno sviluppato il soft agar test formazione di colonie. La morbida agar test formazione di colonie da allora è stato modificato, in anni più recenti, per affrontare spesigenze ecific. Una variante prevede l'incorporazione di colorante fluorometrica per consentire high-throughput conteggio delle colonie. Un'altra variante prevede l'utilizzo di una soluzione di agar specializzata per consentire il recupero di cellule vitali dopo la formazione di colonie quando sono necessari campioni di proteine ​​o di DNA.

Nel tradizionale morbido agar saggio formazione di colonie, le cellule sono coltivate in uno strato di agar morbido mescolato con mezzo di coltura cellulare che poggia su un altro strato di agar molle, anche mescolato con mezzo di coltura cellulare, ma che contengono una maggiore concentrazione di agar. Ciò impedisce alle cellule di aderire alla piastra di coltura, ma consente cellule trasformate per formare colonie visibili. La logica dietro questa tecnica è che le cellule normali dipendono da cellula a contatto della matrice extracellulare in grado di crescere e dividere. Al contrario, le cellule trasformate hanno la capacità di crescere e dividere a prescindere dal loro ambiente circostante. Pertanto, cellule capaci di formare colonie in modo di ancoraggio indipendente erano considered trasformare e cancerogene. L'obiettivo generale di questo metodo consiste nel misurare questa capacità nelle cellule in modo semi-quantitativo e rigoroso.

La via di segnalazione Wnt è fondamentale in embriogenesi e spesso de-regolato nella tumorigenesi ^3-6. Ci sono diversi percorsi associati con segnalazione Wnt. Il percorso canonico prevede di segnalazione Wnt e regolazione della trascrizione genica a valle attraverso i suoi effetti sul coactivator trascrizionale beta-catenina. Wnts segnale anche attraverso diversi percorsi non canonici, per esempio, il percorso planare polarità cellulare, che regola gli elementi coinvolti nella struttura del citoscheletro ^7, e la via di Wnt-calcio, che regola il rilascio del calcio dal reticolo endoplasmatico ^8. Ligandi Wnt esercitano la loro attività attraverso il legame dei recettori Frizzled. Anche se diversi Wnts hanno dimostrato di essere sovraregolata nel cancro del polmone, Wnt7a ha dimostrato di essere down-regolato in non-smalcancro ai polmoni l cellulare attraverso metilazione del promotore ^9. Wnt7a lega Fzd9 e agisce come un soppressore del tumore attraverso un percorso non canonico. Restauro di Wnt-7a e FZD-9 inibisce la crescita di non a piccole cellule di cancro polmonare delle cellule ^10. Gli effetti di Wnt7a / Fzd9 sono mediati attraverso l'attivazione di ERK-5, che a sua volta, attiva perossisomi γ del recettore proliferator-activated (PPAR-gamma) ^11,12. Qui, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di Wnt7a e Fzd9 traduce nella soppressione della crescita ancoraggio-indipendente di una linea cellulare di carcinoma del polmone murino. CMT167 cellule murine sono state derivate da un carcinoma polmonare nei topi C57BL / topi lcrf ¹³ e sono stati stabilmente trasfettate con Wnt7A e Fzd9. Sovraespressione di Wnt7A e Fzd9 sono stati confermati da-PCR quantitativa (Q-PCR) e la funzionalità di Wnt7A e Fzd9 sovraespressione è stata confermata attraverso l'attivazione a valle del PPAR.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali e reagenti

1. Etichettare ciascun pozzetto di una coltura di tessuti trattati 6 pozzetti in modo appropriato per ogni linea cellulare o condizione sotto inchiesta.
2. Preparare 2x terreno di coltura cellulare sciogliendo 1 g di polvere media e 0,2 g di bicarbonato di sodio in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml.
3. Passare questo mezzo attraverso un filtro da 0,2 micron per sterilizzare.
4. Aggiungere componenti aggiuntivi necessari per il normale coltura della linea cellulare di interesse. Ad esempio, crescere CMT linea 167 cellule in terreno RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina soluzione. Medio Riscaldare a 37 ° C in bagno d'acqua calda prima dell'uso.
5. Preparare 1x terreno di coltura cellulare a parte come si farebbe per la coltura delle cellule normali della linea di cellule di interesse.
6. Preparare 1% nobile agar aggiungendo 1 g di agar nobile a 100 ml di acqua deionizzata.
   NOTA: agar Noble non si dissolvono completamente con l'agitazione da solo.
7. Preparare0,6% nobile agar aggiungendo 0,6 g di agar nobile a 100 ml di acqua deionizzata. Entrambe le soluzioni agar possono essere realizzati in 100 ml bottiglie di vetro con coperchi richiudibili per la conservazione a lungo termine.
8. Autoclave le miscele di agar nobili per sterilizzare. Queste miscele possono essere fatte in anticipo e conservati a 4 ° C, ma devono essere riscaldati nuovamente al momento dell'esperimento fino agar si è completamente dissolto.
9. Preparare la soluzione di cloruro di tetrazolio nitroblue facendone / ml di soluzione 1 mg in PBS 1x (8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na ₂ HPO _4, e KH ₂ PO ₄ 0,24 g di H ₂ O a volume finale di 1000 ml ). Questo verrà utilizzato alla fine dell'esperimento per colorare le colonie.

2. placcatura di strato inferiore di Agar

1. Allentare il tappo sulla bottiglia del 1% nobile agar e forno a microonde per circa 1-2 min. Mentre il riscaldamento in un forno a microonde, monitorare attentamente la soluzione per evitare bollente. Si continua il riscaldamento, mentre la miscelazione in modo intermittente,fino agar è completamente sciolto e la soluzione è limpida.
   NOTA: Usare guanti resistenti al calore per gestire pallone dopo il riscaldamento. In caso contrario si potrebbe provocare ustioni o lesioni gravi.
2. Posizionare soluzione agar fuso e pre-riscaldato terreno di coltura 2x in un secchio di ghiaccio riempito con acqua calda (42 ° C). Collocare anche una provetta conica da 50 ml in un portaprovette nel secchio di ghiaccio con acqua calda. Trasferimento secchio per cappa di coltura cellulare per le fasi successive.
3. Per lo strato inferiore di agar, avrete bisogno di 1,5 ml di una miscela di agar e medie per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
4. Per assicurare un'adeguata quantità di miscela, preparare un totale di 12 ml per ogni piastra da 6 pozzetti.
5. Inizia con l'aggiunta di 6 ml di terreno di coltura per il tubo conico da 50 ml e poi 6 ml di soluzione di nobile agar 1%.
6. Invertire il tubo conico più volte per mescolare. Lavorare a passo svelto si evita il rapido indurimento di agar molle.
7. Elaborare circa 5,5 ml di composto in un 5 ml pi sierologicapipetta.
8. Lasciare le bolle d'aria a salire al top della colonna pipetta prima di depositare 1,5 ml di questa miscela in ogni pozzetto. Usare cautela per evitare il deposito di eventuali bolle d'aria nei pozzetti della piastra.
9. Coprire le piastre e lasciare la miscela agar per solidificare a temperatura ambiente, in cappuccio coltura cellulare, per 30 min.

3. Placcatura Lo strato superiore di cellule contenenti Agar

1. Una volta che lo strato inferiore di agar è solidificato, iniziare la preparazione dello strato superiore.
2. In primo luogo, le cellule raccolto mediante tripsinizzazione e diluire li 1: 5 in terreno di coltura (ad esempio per 1 ml di tripsina, aggiungere 4 ml di terreno) in una provetta conica da 15 ml.
3. Contare le cellule e calcolare il numero di cellule necessarie per pozzetto per preparare una sospensione cellulare finale in questo momento. Questo numero può variare a seconda del tipo di cellula. Utilizzare 5.000 cellule / pozzetto come punto di partenza e regolare come necessario. Per questo numero di cellulare, si dovrebbe preparare una sospensione di cellule di 6667 cellule / ml (cioè ogni well riceverà 0,75 ml di questa sospensione e 0,75 ml di agar per un volume totale di 1,5 ml; la concentrazione di cellule sarà diluito 1: 2 per un conteggio finale di cellule totale di 5.000).
4. Il volume di sospensione cellulare necessaria per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti sarà nuovamente 1,5 ml. Preparare sospensione cellulare supplementare per un totale di 12 ml per piastra da 6 pozzetti.
5. Sciogliere soluzione agar 0,6% in un forno a microonde come sopra e riporre in secchiello per il ghiaccio contenente acqua calda con un tubo da 50 ml in un supporto tubo e la sospensione cellulare finale dal punto 3.3.
6. Trasferire il secchiello del ghiaccio con il fuso 0,6% agar per cappa di coltura cellulare per le fasi successive.
7. Mescolare 0,6% agar e sospensione di cellule in un rapporto 1: 1, la preparazione di un volume totale di 12 ml per piastra da 6 pozzetti. 1,5 ml saranno necessari per bene, ma in più devono essere effettuate come sopra.
8. Pipettare 6 ml di sospensione cellulare nel tubo conico da 50 ml.
9. Poi aggiungere 6 ml di 0,6% agar al tubo.
   NOTA: La temperatura di questa miscela deve esseretenuto circa 42 ° C per evitare il rapido indurimento e per massimizzare la sopravvivenza cellulare.
10. Lavorando in fretta, pipetta questa miscela 2-3x per distribuire le cellule, poi elaborare 5,5 ml di composto in un 5 ml pipetta sierologica.
11. Consenti eventuali bolle d'aria a salire a cima della colonna pipetta prima di depositare 1,5 ml di questa miscela in ogni pozzetto. Usare cautela per evitare il deposito di eventuali bolle d'aria nei pozzetti della piastra.
12. Lasciare miscela cellulare / agar per solidificare a temperatura ambiente, in cappuccio coltura cellulare, per 30 minuti prima di mettere in un 37 ° C coltura cellulare incubatore umidificato.
13. Il tempo necessario per un'adeguata formazione di colonie varia per ogni linea cellulare, tipicamente circa 21 giorni.
14. Uno strato di terreno di coltura deve essere mantenuta al di sopra dello strato superiore di agar per prevenire l'essiccamento. 100 pl di mezzo aggiunto due volte a settimana è sufficiente per questo scopo.

4. Colorazione le piastre e il conteggio delle colonie

1. Cellule Macchia con l'aggiunta di 200 _6; l di soluzione di cloruro nitroblu tetrazolio per pozzetto e incubando le piastre per una notte a 37 ° C.
2. Una volta che le colonie sono macchiati, scattare fotografie di pozzi con un imager e contare le colonie utilizzando il software di analisi delle immagini.

Risultati

L'espressione di Wnt7A e Fzd9 in CMT167 cellule è efficace nella soppressione del tumore, come illustrato dal nostro morbido agar test formazione di colonie. In via preliminare, abbiamo utilizzato Q-PCR per dimostrare che Wnt7A e Fzd9 mRNA sono espressi in livelli bassi in CMT167 cellule. Cellule CMT167 mostrato bassi livelli di endogena Wnt7A e Fzd9 rispetto a MLE-12 celle, un murino linea cellulare epiteliale polmonare SV40-trasformato (Figura 1). Abbiamo poi trasfettato CMT167 cellule con due ve...

Discussione

A conferma vitro della funzione soppressiva tumorale di proteine ​​di segnalazione è difficile. Uno dei test più rigorosi a disposizione per indagare questa proprietà è il soft agar saggio di formazione di colonie. Qui, abbiamo illustrato il morbido test formazione di colonie agar utilizzando una linea cellulare di carcinoma del polmone murino stabile sovraespressione Wnt7a e Fzd9 rispetto alla sua linea cellulare CMT167 dei genitori.

Ci sono diversi punti important...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket