A Formação Ensaio macio Agar Colony

Resumo

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Resumo

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introdução

O ensaio de formação de colónia em agar mole é uma técnica amplamente utilizada para avaliar a transformação celular in vitro. Historicamente, um outro ensaio, o ensaio clonogénico, descrito por Puck et al., Em 1956, foi utilizado para avaliar a capacidade das células para formarem colónias ^1. Nesta técnica, as células foram dispersas numa placa de cultura e cultivadas na presença de células "alimentadoras" ou meio condicionado para fornecer factores de crescimento necessários. A limitação dessa técnica é que ele só forneceu informações sobre a formação de colônias. As células normais são impedidas de crescimento independente de ancoragem, devido a um determinado tipo de morte apoptótica, chamado anoikis ^2. No entanto, as células transformadas têm a capacidade de crescer e dividir-se sem se ligar a um substrato. Para capitalizar sobre este conceito, os pesquisadores desenvolveram o ensaio de formação de colônia agar macio. O ensaio de formação de colónia em agar mole foi modificado desde que, nos anos mais recentes, para tratar spnecessidades ecific. Uma variação envolve a incorporação de corante fluorométrico para permitir a high-throughput contagem de colónias. Outra variação envolve a utilização de solução de agar especializada para permitir a recuperação de células viáveis ​​após a formação de colónias quando são necessárias amostras de proteína ou de ADN.

No ensaio de formação de colónia em agar mole tradicional, as células são cultivadas numa camada de agar mole misturado com meio de cultura de células que repousa sobre uma outra camada de agar mole, também misturado com meio de cultura celular, mas que contém uma maior concentração de ágar. Isto impede que as células adiram à placa de cultura, ainda permite células transformadas de modo a formar colónias visíveis. O raciocínio por detrás desta técnica é que as células normais de células dependem de contacto de matriz extracelular para ser capaz de crescer e dividir. Por outro lado, as células transformadas têm a capacidade de crescer e dividir independentemente do seu ambiente circundante. Portanto, as células capazes de formar colónias de uma forma independente de ancoragem foram cConsiderado para ser transformada e carcinogénico. O objetivo geral deste método é medir essa capacidade das células de uma forma semi-quantitativa e rigorosa.

A via de sinalização Wnt é essencial na embriogênese e muitas vezes de-regulada na tumorigênese ^3-6. Existem vários caminhos associados à sinalização Wnt. A via de sinalização Wnt canônica envolve e regulação da transcrição de genes a jusante através de seus efeitos sobre o coactivator transcricional beta-catenina. Wnts também sinalizar através de várias vias não canónicos, por exemplo, a via planar polaridade celular, que regula os elementos envolvidos na estrutura do citoesqueleto ^7, e da via Wnt-cálcio, que regula a libertação de cálcio do retículo endoplasmático ^8. Ligantes Wnt exercer a sua actividade através de receptores Frizzled obrigatório. Embora vários Wnts foram mostrados para ser regulada positivamente em cancro do pulmão, Wnt7a demonstrou ser regulada para baixo em não-smalcâncer de pulmão de células l através metilação do promotor ^9. Wnt7a se liga Fzd9 e actua como um supressor de tumor através de uma via não-canónica. Restauração de Wnt-7a e FZD-9 inibe o crescimento de células não-pequenas de cancro do pulmão de células ^10. Os efeitos da Wnt7a / Fzd9 são mediados através da activação de ERK-5, que por sua vez, activa γ do receptor activado por proliferador de peroxissoma (PPARy) ^11,12. Aqui, mostramos que a sobre-expressão de Wnt7a e Fzd9 resulta na supressão do crescimento independente de ancoragem de uma linha de células de carcinoma de pulmão de murino. CMT167 células de ratinho foram derivadas de um carcinoma do pulmão em ratos C57BL / ¹³ e lcrf ratinhos foram estavelmente transfectadas com Wnt7a e Fzd9. A sobre-expressão de Wnt7a e Fzd9 foram confirmados por PCR quantitativo e em (Q-PCR) e a funcionalidade de Wnt7a e Fzd9 superexpressão foi confirmada através da activação de PPARy jusante.

Protocolo

1. Preparação de Materiais e Reagentes

1. Rotular cada poço de uma cultura de tecido de 6 poços tratados placa de forma adequada para cada linha de célula ou condição a ser investigada.
2. Prepare meio de cultura de células 2x por dissolução de 1 g de meio em pó e 0,2 g de bicarbonato de sódio em água desionizada até um volume final de 50 ml.
3. Passa este meio através de um filtro de 0,2 um para esterilizar.
4. Adicionar os componentes adicionais necessários para a cultura normal da linha celular de interesse. Por exemplo, crescer CMT linha 167 das células em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina solução. Aquece-se a média de 37 ° C em banho de água quente antes de ser utilizado.
5. Prepare meio de cultura celular 1x separadamente, como você faria para cultura de células normais da linha de células de interesse.
6. Prepare 1% de agar nobre por adição de 1 g de agar nobre a 100 ml de água desionizada.
   NOTA: ágar Noble não se dissolverá completamente com agitação só.
7. Preparar0,6% de agar nobre por adição de 0,6 g de agar nobre a 100 ml de água desionizada. Ambas as soluções de agar podem ser feitas em garrafas de 100 ml de vidro com tampas que podem ser fechadas para armazenagem a longo prazo.
8. Autoclave as misturas de agar nobres para esterilizar. Estas misturas podem ser feitas com antecedência e guardadas a 4 ° C, mas deve ser aquecido novamente no momento do experimento de agar até se ter dissolvido completamente.
9. Preparar a solução de cloreto de tetrazólio nitroazul, fazendo uma solução mãe de 1 mg / ml em 1x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, e 0,24 g _de KH ₂ PO ₄ em _H2O para volume final de 1000 ml ). Isto irá ser utilizado no final da experiência para corar as colónias.

2. chapeamento de camada inferior de Agar

1. Solte a tampa na garrafa de 1% agar nobre e micro-ondas por cerca de 1-2 min. Durante o aquecimento no microondas, monitorar de perto a solução para evitar a ferver. Continuar o aquecimento, enquanto se mistura intermitentemente,ágar até estar completamente dissolvido e a solução é clara.
   NOTA: Use luvas resistentes ao calor para lidar com frasco após o aquecimento. Não fazer isso pode causar queimaduras ou ferimentos graves.
2. Coloque solução agar derretido e pré-aquecido meio de cultura 2x em um balde de gelo cheia de água quente da torneira (42 ° C). Também se coloca um tubo cónico de 50 ml num suporte de tubos no balde de gelo com água quente. Balde para capa de cultura de células de transferência para as etapas subseqüentes.
3. Para a camada inferior de agar, vai precisar de 1,5 ml de uma mistura de agar e meio por poço de uma placa de 6 poços.
4. Para garantir uma quantidade adequada da mistura, preparar um total de 12 ml para cada placa de 6 poços.
5. Comece por adição de 6 ml de meio de cultura para o tubo de 50 ml e em seguida 6 ml de solução de agar nobre a 1%.
6. Inverter o tubo cónico várias vezes para misturar. Trabalhando em um ritmo acelerado irá prevenir o endurecimento prematuro do agar macio.
7. Elaborar cerca de 5,5 ml de mistura em um 5 ml pi sorológicapette.
8. Permitir que as bolhas de ar a subir para o topo da coluna antes de depositar pipeta 1,5 ml desta mistura para cada poço. Tenha cuidado para evitar a deposição de quaisquer bolhas de ar nos poços da placa.
9. Cobrir as placas e permitir uma mistura de agar a solidificar à temperatura ambiente, na capa de cultura de células, durante 30 min.

3. chapeamento camada superior do agar contendo células

1. Uma vez que a camada inferior de agar ter solidificado, começar a preparação da camada superior.
2. Em primeiro lugar, as células de colheita por tripsinização e diluí-los 1: 5 em meio de cultura (por exemplo, para 1 ml de tripsina, adicionar 4 ml de meio) num tubo de 15 ml.
3. Contagem de células e calcular o número de células por poço necessários para preparar uma suspensão de células final neste momento. Este número irá variar dependendo do tipo de célula. Use 5.000 células / poço como ponto de partida e ajustar, conforme necessário. Para este número de celular, você iria preparar uma suspensão de células de 6.667 células / ml (ou seja, cada poçol receberão 0,75 mL desta suspensão e 0,75 ml de ágar para um volume total de 1,5 ml; a concentração de células também será diluído 1: 2 para uma contagem de células total final de 5000).
4. O volume de suspensão de células por poço necessária de uma placa de 6 poços irá novamente ser de 1,5 ml. Prepare suspensão de células adicional totalizando 12 ml por 6 poços.
5. Derreter solução de agar a 0,6% em um micro-ondas como acima e colocar em balde de gelo contendo água quente juntamente com um tubo de 50 ml num suporte de tubos e a suspensão celular final do Passo 3.3.
6. Transfira o balde de gelo derretido com 0,6% de agar para capa de cultura de células para as etapas subseqüentes.
7. Misture 0,6% de agar e suspensão de células numa proporção de 1: 1, preparando-se um volume total de 12 ml por placa de 6 poços. 1,5 ml vai ser necessária por poço mas extra deve ser feita como acima.
8. Pipetar 6 ml de suspensão de células para o tubo de 50 ml.
9. Em seguida, adicionar 6 mL de 0,6% de agar para o tubo.
   NOTA: A temperatura desta mistura deve sermantido em torno de 42 ° C para evitar o endurecimento prematuro e para maximizar a sobrevivência celular.
10. Trabalhando rapidamente, pipeta esta mistura 2-3x para distribuir células, em seguida, elaborar 5,5 ml de mistura em uma pipeta de 5 ml sorológica.
11. Permitir que as bolhas de ar a subir para o topo da coluna antes de depositar pipeta 1,5 ml desta mistura para cada poço. Tenha cuidado para evitar a deposição de quaisquer bolhas de ar nos poços da placa.
12. Permitir mistura de células / agar para solidificar à temperatura ambiente, na capa de cultura de células, durante 30 minutos antes de colocar um 37 ° C humidificado incubadora de cultura de células.
13. O tempo necessário para a formação de colónias adequada varia para cada linha celular, tipicamente cerca de 21 dias.
14. Uma camada de meio de crescimento deve ser mantido ao longo da camada superior de ágar-ágar para evitar a dessecação. 100 ul de meio adicionado duas vezes por semana é suficiente para esta finalidade.

4. coloração das placas e contagem de colônias

1. Células Stain, adicionando 200 _6; l de solução de cloreto de tetrazólio nitroazul por cavidade e incubando as placas durante a noite a 37 ° C.
2. Uma vez que as colônias estão manchadas, tirar fotografias de poços utilizando um gerador de imagens e contagem das colónias, usando software de análise de imagem.

Resultados

A expressão de Wnt7a e Fzd9 em CMT167 células é eficaz na supressão de tumores, como ilustrado pelo nosso ensaio de formação de colónia em agar mole. Preliminarmente, utilizou-Q-PCR para mostrar que Wnt7a Fzd9 ARNm e são expressos em níveis baixos em células CMT167. CMT167 células mostraram níveis baixos de Wnt7a endógena e Fzd9 quando comparado com células MLE-12, uma linha de células epiteliais de pulmão de murino transformadas com SV40 (Figura 1). Em seguida, transfectadas CMT167 cél...

Discussão

Em confirmação vitro da função supressora tumoral de proteínas de sinalização é difícil. Um dos ensaios mais rigorosos disponíveis para investigar essa propriedade é o ensaio de formação de colônia agar macio. Aqui, ilustramos o ensaio de formação de colónia em agar macio, utilizando uma linha de células de carcinoma de pulmão de murino que sobre-expressa de forma estável e Wnt7a Fzd9 em comparação com a sua linha de células parental CMT167.

Há vári...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket