Формирование Анализ Soft Агар колонии

Резюме

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Аннотация

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Введение

Мягком агаре образование колоний анализ представляет собой метод широко используется для оценки клеточной трансформации в пробирке. Исторически сложилось так, другой тест, клоногенности, описывается шайба и др. В 1956 г. был использован для оценки способности клеток образовывать колонии ^1. В этой технике, клетки были рассеяны на культуральную чашку и выращивают в присутствии '' фидерных клеток или кондиционированной среды, чтобы обеспечить необходимые ростовые факторы. Ограничение этого способа в том, что это только при условии, информацию в отношении образования колоний. Нормальные клетки не имеют возможности крепления-независимого роста, из-за того или иного вида апоптоза, называемой anoikis ^2. Тем не менее, трансформированные клетки обладают способностью расти и делиться без привязки к подложке. Чтобы извлечь выгоду из этой концепции, исследователи разработали программную агар анализа формирования колонии. Мягком агаре анализ образование колоний с тех пор были изменены, в последние годы, для решения Specific потребности. Один из вариантов включает включение флуорометрического красителем, чтобы позволить для подсчета колоний высокой пропускной. Еще один вариант предполагает использование специализированного раствора агара, чтобы обеспечить извлечение жизнеспособных клеток после образования колоний, когда белок или ДНК пробы нужны.

В традиционном мягком агаре колонии анализа пласта, клетки выращивают в слое мягком агаре, смешанного с клеточной культуральной среде, которая лежит на другом слое мягком агаре, также в смеси с клеточной культуральной среды, но содержащий более высокую концентрацию агара. Это предотвращает клетки от присоединения к культурального планшета, пока позволяет трансформированные клетки образуют видимые колонии. Смысл этого метода является то, что нормальные клетки зависит от клетки к внеклеточной матрицы контакте, чтобы иметь возможность расти и делиться. И наоборот, трансформированные клетки обладают способностью к росту и делению, независимо от окружающей их среды. Таким образом, клетки, способные образовывать колонии в опоре-независимым способом были Considered должны быть преобразованы и канцерогенными. Общая цель этого метода заключается в измерении эту возможность в клетках в полу-количественного и строгой манере.

Сигнальный путь Wnt является критическим в эмбриогенезе и часто де-регулируется в онкогенеза ^3-6. Есть несколько путей, связанные с Wnt сигнализации. Канонический путь включает Wnt сигнализацию и регулирование вниз по течению транскрипции генов через его влияние на транскрипционный коактиватора бета-катенина. Wnts также сигнализировать через несколько неканонические путей, например, плоской клеточной полярности путь, который регулирует элементы, участвующие в структуре цитоскелета ^7, и путь Wnt-кальция, который регулирует высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума ^8. Wnt лигандов проявляют свою активность посредством связывания Frizzled рецепторы. Хотя несколько Wnts, как было показано, чтобы быть активируется при раке легкого, Wnt7a было показано, что подавляется в не-Smalрак легких л клеток через метилирования промоторов ^9. Wnt7a связывает Fzd9 и действует как подавитель опухоли через неканонической пути. Восстановление Wnt-7а и FZD-9 подавляет рост немелкоклеточного рака легкого ячеек ^10. Эффекты Wnt7a / Fzd9 опосредованы активацией ERK-5, который, в свою очередь, активирует пероксисом γ-рецептора активатора пролиферации (PPAR, ^11,12). Здесь мы показываем, что избыточная экспрессия Wnt7a и Fzd9 приводит к подавлению крепления независимый рост мышиной линии карциномы легкого клеток. Мышиные CMT167 клетки были получены из карциномы легких у C57BL мышей / ¹³ КЗоТ и были стабильно трансфицированные Wnt7a и Fzd9. Сверхэкспрессия Wnt7a и Fzd9 были подтверждены количественного-ПЦР (Q-PCR) и функциональности Wnt7a и Fzd9 гиперэкспрессией было подтверждено через потоку активации PPAR,.

протокол

1. Подготовка материалов и реагентов

1. Этикетка каждую лунку культуре ткани обрабатывают 6-луночного планшета соответственно для каждой клеточной линии или состояния, которое исследованы.
2. Подготовьте 2x клеточную культуральную среду путем растворения 1 г порошка среды и 0,2 г бикарбоната натрия в деионизированной водой до конечного объема 50 мл.
3. Передайте эту среду через 0,2 мкм фильтр для стерилизации.
4. Добавить дополнительные компоненты, необходимые для нормальной культуры клеточной линии, представляющей интерес. Например, растут СМТ линию 167 клеток в RPMI 1640 среде, дополненной 10% FBS и 1% раствор пенициллина / стрептомицина. Теплый среднего до 37 ° С в ванну с горячей водой перед использованием.
5. Приготовьте 1х клеточную культуральную среду отдельно, как для нормальной клеточной культуре клеточной линии, представляющей интерес.
6. Приготовьте 1% агар благородный путем добавления 1 г благородный агар до 100 мл деионизированной воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Благородный агар не растворится полностью при перемешивании в одиночку.
7. Подготовить0,6% благородный агар, добавив 0,6 г благородный агар в 100 мл деионизированной воды. Оба агар растворы могут быть сделаны в 100 мл стеклянных бутылках с закрывающимися крышками для длительного хранения.
8. Автоклав благородные агар смеси для стерилизации. Эти смеси могут быть сделаны заранее и хранили при 4 ° С, но следует снова нагревали в момент эксперимента, пока агар полностью не растворится.
9. Подготовьте нитросинем раствора хлорида тетразолия, сделав 1 мг / мл маточного раствора в 1х PBS (8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na ₂ HPO _4, и 0,24 г КН ₂ РО ₄ в H ₂ O до конечного объема 1000 мл ). Это будет использоваться в конце эксперимента, чтобы окрасить колоний.

2. Покрытие из нижнего слоя агара

1. Ослабить крышку на бутылке 1% благородного агар и микроволновой печью около 1-2 мин. При нагревании в микроволновой печи, следить за решение тесно, чтобы избежать при кипении. Продолжайте нагревание, при смешивании с перерывами,пока агар полностью не растворится и раствор не станет прозрачным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте термостойкие перчатки для обработки колбу после нагревания. Несоблюдение этого требования может привести к ожогам или серьезным травмам.
2. Поместите расплавленный раствор агара и предварительно нагревают 2x культуральную среду в ледяной ведро с горячей водой (42 ° С). Кроме разместить 50 мл коническую трубку в держателе трубки в ведро со льдом с горячей водой. Трансфер ведро на капот культуре клеток для последующих шагов.
3. Для нижнем слое агара, понадобится 1,5 мл смеси агара и среды на лунку 6-луночного планшета.
4. Чтобы обеспечить достаточное количество смеси, готовят в общей сложности 12 мл для каждой 6-луночного планшета.
5. Начало добавлением 6 мл культуральной среды в 50 мл коническую пробирку, а затем 6 мл 1% раствора агара благородного.
6. Обратить конической трубе несколько раз перемешать. Работа в быстром темпе будет предотвратить преждевременное затвердевание мягкого агара.
7. Составьте примерно 5,5 мл смеси в 5 мл серологической пиPette.
8. Разрешить пузырьки воздуха, чтобы подняться до верхней части колонны пипетки перед нанесением 1,5 мл этой смеси в каждую лунку. Будьте осторожны, чтобы избежать осаждения пузырьков воздуха в лунки планшета.
9. Покрытие пластин агара и позволяют смеси затвердеть при комнатной температуре, в капот культуре клеток, в течение 30 мин.

3. Покрытие верхнего слоя агара, содержащие клетки

1. После того, как нижний слой агара затвердеет, начать подготовку верхнего слоя.
2. Во-первых, урожай клеток путем обработки трипсином и разбавить их 1: 5 в культуральной среде (например, на 1 мл трипсина, добавить 4 мл среды) в 15 мл коническую пробирку.
3. Граф клеток и рассчитать количество клеток на лунку, необходимых для получения конечной суспензии клеток в это время. Это количество будет варьироваться в зависимости от типа клеток. Используйте 5000 клеток / лунку в качестве отправной точки и корректировать по мере необходимости. Для этого числа клеток, вы бы подготовить клеточной суспензии из 6667 клеток / мл (т.е. каждый вэйл получит 0,75 мл этой суспензии и 0,75 мл агара для общего объема 1,5 мл; концентрация клеток будет также разводили 1: 2 для конечного общего количества клеток в 5000).
4. Объем клеточной суспензии, необходимой на лунку 6-луночного планшета с вновь будет 1,5 мл. Подготовьте дополнительный клеточной суспензии на общую сумму 12 мл на 6-луночный планшет.
5. Melt 0,6% раствора агара в микроволновой печи, как указано выше, и поместите в ведре со льдом, содержащей горячую воду вместе с 50 мл коническую пробирку в держателе трубки и конечной суспензии клеток со стадии 3.3.
6. Трансфер ведро со льдом с топленым 0,6% агара в капот культуре клеток для последующих этапов.
7. Смешайте 0,6% агара и клеточной суспензии в соотношении 1: 1, готовит общий объем 12 мл на 6-луночный планшет. Потребуется 1,5 мл на лунку, но дополнительное должны быть сделаны, как описано выше.
8. Пипетка 6 мл клеточной суспензии в 50 мл коническую пробирку.
9. Затем добавляют 6 мл 0,6% агара к трубе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура этой смеси должна бытьхранится около 42 ° C, чтобы избежать преждевременного затвердевания и максимизировать выживание клеток.
10. Работа быстро, пипетка эту смесь 2-3 раза распространять клетки, затем составить 5,5 мл смеси в 5 мл серологические пипетки.
11. Разрешить пузырьки воздуха, чтобы подняться на вершину колонны пипетки перед нанесением 1,5 мл этой смеси в каждую лунку. Будьте осторожны, чтобы избежать осаждения пузырьков воздуха в лунки планшета.
12. Разрешить клеток / агар смесь затвердевать при комнатной температуре, в капот культуре клеток, в течение 30 мин перед помещением в 37 ° C увлажненном инкубаторе культуры клеток.
13. Время, необходимое для адекватного образования колоний варьирует для каждой клеточной линии, как правило, около 21 дней.
14. Слой ростовой среды следует поддерживать на верхнем слое агара, чтобы предотвратить высыхание. 100 мкл среды, дополненной два раза в неделю достаточно для этой цели.

4. окрашивания пластин и Подсчет колоний

1. Пятно клетки, добавляя 200 _6; л тетразола раствора хлорида на лунку и инкубирования пластин в течение ночи при 37 ° С.
2. После того, как колонии окрашиваются, фотографировать скважин с использованием тепловизора и рассчитывать колонии, используя программное обеспечение для анализа изображений.

Результаты

Выражение Wnt7a и Fzd9 в CMT167 клеток является эффективным в подавлении опухолевого как свидетельствует наша мягкой агар анализа формирования колонии. Предварительно, мы использовали Q-PCR, чтобы показать, что Wnt7a и Fzd9 мРНК выражены в низких уровнях в CMT167 клеток. CMT167 клетки показали низкий уров?...

Обсуждение

Экстракорпоральное подтверждения опухоли подавляющих функцию сигнальных белков трудно. Один из самых строгих анализов, доступных для расследования этого имущества является мягкий агар анализ образования колоний. Здесь мы проиллюстрировали мягкий агар анализа формирования кол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket