在脊髓损伤的实验挫伤型号神经干细胞移植

摘要

脊髓损伤是一种创伤性条件，导致严重的发病率和死亡率高。在这项工作中，我们详细描述脊髓损伤的小鼠，随后通过神经干细胞的移植挫伤模型。

摘要

脊髓损伤是一种破坏性的临床状况，其特征在于神经机能障碍的复合体。脊髓损伤的动物模型，可以同时使用，调查的生物反应损伤和测试潜在疗法。挫伤或压迫损伤传递到外科手术暴露脊髓是最广泛使用的模型的病理状况。在此报告的实验挫伤通过使用无穷水平（1H）撞击的设备，它允许创建一个可再现损伤动物模型中，通过具体的损伤参数定义进行。干细胞移植通常被认为用于固化本衰弱病症的潜在有用的策略。大量的研究已经评估移植了各种干细胞的影响。在这里，我们证明了脊髓损伤后尾静脉注射细胞在CD1小鼠的适应方法。总之，我们提供的程序:一）细胞标记无线网络第一个重要的示踪物，ⅱ）手术前护理小鼠，ⅲ）执行的挫伤性脊髓损伤，和验尸神经前体的四）静脉内给药。这个挫伤模型可以用于评估在再生医学的方法的有效性和干细胞移植的安全性。

引言

脊髓损伤（SCI）是由高能量创伤样机动车事故中最常见的损伤，跌伤，运动和暴力^1。在严重的SCI，伤害力摧毁或损害的神经组织，引起神经功能突然丧失。外伤性脊髓损伤经常发生在10和40岁之间的青壮年。这极大地影响了患者的精神和身体状况，并导致巨大的经济影响，社会^2。在急性期的治疗方法往往仅限于高剂量糖皮质激素，手术稳定和减压，以减轻可能进一步损害^3-4，但是SCI后，这些方法在运动恢复中的作用仍存在争议。除了 ​​急性组织丢失，跌打损伤和退行性变引起脱髓鞘多种细胞类型^5-6和死亡继发性机制的激活。功能恢复程度可以了10被关联到幸免脑白质的损伤部位⁷的程度。

脊髓损伤的动物模型，可以使用这两种，调查组织损伤的生物反应，并测试潜在的治疗方法。此外，人体病理学的有用的动物模型不仅具有重现该条件的某些方面，但还必须提供超过直接的临床观察和实验的优点。脊髓损伤的最广泛使用的模型包括挫伤或压迫损伤传递到外科手术暴露脊髓^8。受控体重下降挫伤的发展代表了SCI研究史上的一个重要里程碑。俄亥俄州立大学脊髓研究中心一直追求可用于诱导脊髓与冲击的由计算机⁹控制参数的特定压缩设备的技术挑战。这原本是专为使用无线网络日大鼠;后来它被修改申请对小鼠^10。这种方法的优点是，损伤的生物力学能在深入研究以上和损伤的参数可以在一个更完整的方式，以获得一个重现的实验模型来限定，因此，允许的效果更精确的评估测试治疗对功能恢复的过程。

许多研究已评估了移植的效果在脊髓损伤模型¹¹的各种干细胞。我们最近分离出的子脑室区（SVZ）几个小时成人神经干细胞的老鼠捐助^12-13死后。此过程提供了神经干细胞，称为后验神经前体（PM-NPC的），这似乎是在再生医学的方法用于治疗脊髓损伤有利的群体。在本文中，我们将证明:i）在细胞标记协议的重要示踪剂PKH26，II）的外科学的iCal过程在外伤性脊髓损伤执行，以及iii）在静脉内（IV）标记的细胞的施用。另外，在本工作中，我们表明，移植的细胞移植到脊髓损伤部位并分化大多成微管相关蛋白（MAP）2阳性的细胞。此外，该分化伴有促进后肢功能的稳定的恢复。

研究方案

注:所有的程序批准了米兰大学的审查委员会，并会见了意大利指南实验动物符合欧共体指令日期为1986年11月（609分之86/ EEC）。

1.准备细胞移植

注:在第5次和在培养中对这些实验的第九通道之间使用的神经干细胞;被贴上了移植前的测试对于文化增殖和分化能力。免疫细胞化学¹²确定差异化的程度。

1. 重悬的细胞以1×10 ^6个细胞/ 150微升（移植每只小鼠1×10 ⁶个细胞）的浓度。因为过量的细胞所需的注射器装载目的准备至少1.2×10 ⁶细胞每只小鼠。
2. 在10毫升的锥形瓶中洗涤细胞用神经干细胞的培养基¹³的3倍。在每洗涤工序中，沉淀的细胞通过离心（500×g离心5分钟，RT）。
3. 在最后的旋转之前计数细胞。
4. 离心细胞（500×g离心5分钟），然后吸出上清液，注意不要以除去任何细胞，但留下不超过25微升上清液。
5. 通过加入1ml稀释剂的C向细胞沉淀重悬在温和移液制备2倍的细胞悬浮液。
6. 立即染色前，准备了2倍染料溶液（4×10 ^{- 6} M）中稀释下通过加入4微升PKH26乙醇染料溶液到1ml稀释液C在一个管中，充分混合以分散。
7. 迅速加入1毫升2×细胞悬浮到1ml 2×染料溶液，并立即通过吹打混匀（最终细胞密度将是1.2×10 ⁷个细胞/ ml和2×10 ^{- 6M的} PKH26）。
8. 孵育细胞/染料悬液1-5分钟。
9. 通过加入等体积的停止染色（2-毫升）在HBSS中的1％BSA溶液孵育1分钟。
10. 离心机细胞（500 XG 10分钟），并小心地取出上清。
11. 重悬细胞沉淀在10ml的HBSS和离心机（500×g离心5分钟）的。
12. 用10ml完全培养基洗细胞沉淀2次以上，以确保去除未结合的染料。
13. 重悬细胞沉淀在10ml细胞回收，细胞生存力和荧光强度的评估完全培养基。如果需要的细胞用于移植，洗涤，并在3.3×10 ⁵个细胞/ 50微升的浓度重悬他们在无菌生理溶液。

2.准备手术

1. 清洁和消毒的手术设备。
2. 通过用无菌试剂擦拭准备手术区域。成立了IH撞击装置。
3. 准备麻醉设备:主动气体清除剂，含有VetScav过滤称重装置，连续流动感应商会，氧气的基因rator，低流量O ₂米的小鼠。清洁感应腔和手术过程中使用的掩模。
4. 麻醉动物，用2.5％（体积/体积）的异氟烷在氧气中（1L /分），并等待5分钟的流动诱导的药物生效后。检查晶须抽搐或如果有缓慢后肢撤回响应于夹持足垫。在手术过程中，降低了异氟醚浓度为2.0％（体积/体积）的异氟烷在氧气中（1升/分钟）。

3.准备小鼠外科手术和移植

1. 保持雄性成年CD1小鼠（25-30克）至少3天的标准条件下的实验（22±2°C，湿度65％，与上午08时00分之间的人造光至08:00时）之前。
   注:从手术准备，​​缝合，整个过程需时约40分钟。
   1. 为了识别动物，标志着尾由防水彩色墨水的手段。
2. 使用ELECTRIC推剪切小鼠的背部毛从颈部，大约在T2的水平，到腰区。
3. 用碘溶液和乙醇（在无菌水中70％）消毒准备好的区域。
4. 治疗与子皮下（SC）注射200μl的庆大霉素（1毫克/毫升在无菌盐水中的溶液）的动物。
5. 适用的眼用润滑剂包括动物的眼睛，以防止干燥，并注入丁丙诺啡（皮下，0.03毫克/公斤），以减轻疼痛。

4.椎板切除术

1. 放置在幻灯片温暖鼠标，以避免在手术过程中低温的问题。定位与背侧的动物。
2. 使一个纵切口，用手术刀在感兴趣的区域中，从T7至T12。
3. 持皮肤和浅表脂肪垫通过使用标准钳子（通常在^第 5 ^次和^第 6 ^次胸椎背侧进程之间的空间中找到）。
4. 算该容器作为T6下的过程然后移动到T7。
5. 将鼠标的腹侧下一点轴承以提高脊柱的曲率。通过与格雷夫钳子阻止它固定的脊髓。
6. 通过使用手术刀，直到接触层手术刀头背表面切椎旁肌两侧从T7和T10椎体水平。
7. 用手术刀剔掉从T7交界处，直到T10。停止在T8和T9的刺状突起之间的空间。切T8-T9和T9-T10之间的组织与微剪刀。
   1. 用咬骨钳去除T9过程。通过仔细地刮走的肌肉层与微剪刀暴露的交界处。继续下去，直到骨头暴露。
8. 使用镊子，从薄层除去肌肉和打开椎骨之间的小空间。轻轻插入微型剪刀骨下，削减双方的椎板和删除这部分用钳子。
9. 与F移除椎板orceps揭露线。确保不留下任何免费或锯齿状的碎骨落后;用咬骨钳去除它们。
10. 使用小尖镊子除去骨膜以及任何骨碎片或肌肉可以是附近的切口。
11. 取出T9背过程中的上半部分，并继续向IH冲击器设备协议。

5. IH冲击器设备协议（挫伤）

1. 鼠标放置在的IH冲击器设备的稳定平台的中间。
2. 阻止与两个合资定位臂与稳定的平台连接两个牙钳动物（左臂为胸椎，右手臂颈椎）。
3. 使用喙臂把握喙椎体（T8）的横向边缘。
4. 操纵尾臂以相同的方式来把握的T10椎体。
5. 将稳定平台的设备，降低头（直径0.75毫米），为接近帘线尽可能不接触它。
6. 发起冲击前，抬起头三个完整圈。
7. 与撞击器设置为递送的60 kdyn的力，在100毫米/秒执行挫伤。

6.缝线和后护理

1. 缝合切口用4/0可吸收缝合线。在覆盖层去除的部位暴露脊髓;通过小针的方式缝合的组织在切割的末端。把两针上面，立即和脊髓照射下的网站。
2. 收使用两个或三个反射剪辑，而不会夹断底层肌肉皮肤。
3. 水合小鼠手术后用2ml生理盐水溶液皮下注射在后腰。
4. 鼠标放置回一个预热笼，以避免在手术恢复体温过低。地方笼上加热垫。
5. 通过检查监督，在急性期后损伤的小鼠大小膀胱，缝线和动物体重，一天两次。轻轻挤压膀胱（每天两次，连续7天），以避免尿路的感染（尿液可能是阴天，血性或含有任何沉淀物）。
6. 每天用生理盐水溶液注射治疗的小鼠一次（2毫升两天手术后皮下注射）和抗生素（庆大霉素0.2毫升;皮下注射）五天后的损伤。
7. 治疗小鼠术后镇痛丁丙诺啡（0.1毫克/千克;每天两次）处理3天后的损伤。

7.尾静脉注射细胞

注意:在下面的步骤用于注入细胞到尾静脉的步骤是证明。细胞可以也给予了椎管内移植用立体框架^15-16，或枕大池^17。要考虑到其他类型的细胞可以用这种方法进行移植，如间充质基质细胞是很重要的（ 例如 ，骨髓间充质干细胞，脂肪来源的干细胞，羊水细胞）。此外，其他的治疗方案，如纳米粒子可经尾静脉对脊髓损伤后注入。

1. 用70％的乙醇和PBS清洗后再使用针头。处理的针和注射器只与无菌手套。
2. 重悬的细胞在试管和负载75微升细胞向0.3 ml注射器（29克针和0.33毫升注射器）。
3. 确保没有气泡细胞悬液中存在。保持注射器在水平位置，以避免细胞沉淀。
4. 将鼠标灯具的散热下方扩张尾静脉。
5. 抢鼠标轻轻就拉进了鼠标阻挡器可视化的侧面尾静脉的狭窄的蓝线。
6. 清洁用酒精棉签尾巴。一旦静脉被可视化，抓住尾部静脉中指左手和拇指之间。
7. 把针表面从地平线15°角，并确保斜角到了。
8. 注射50微升的细胞以0.33微升/秒的速率。注射后，以10秒的延迟针的回缩。收回针头缓慢，注意细胞悬液的可能外流。
9. 清洁注射器在负载之间步7.1。

8.行为测试和后肢功能

1. 鼠标放置在开放的领域。
2. 挫伤与根据巴索鼠标规模^{（BMS）18上}的旷场试验后评价运动功能和后肢恢复。
   注:神经功能必须定期伤后4周¹⁸评定，从第3天。

9.灌注

1. 在实验期结束时，通过腹膜内注射戊巴比妥钠（65毫克/千克）麻醉动物。用脚趾捏到evaluatE中的麻醉水平，并继续后，才鼠标反应迟钝的有害刺激。
2. 抑制动物在手术平面上的仰卧位。
3. 通过体壁和腹壁只是肋骨下方切开。分离肝脏隔膜。
4. 使用剪刀剪开膜片以暴露胸膜腔。
5. 切肋骨两侧，直到锁骨。
6. 用止血钳剑突软骨，然后将止血钳在头上。
7. 保持心脏的倒数第三与钳横向平面内。针插入左心室。
8. 用止血钳的心脏。此固定针，并防止泄漏。
9. 用剪刀剪断右心房。
10. 使PBS以通过动物泵（18毫升/分钟）。保持整个缓冲器输注期间该压力（3-4分钟;对应于约70毫升PBS）中。继续下去，直到心脏是干净的。
11. 切换活塞以允许固定液（4％多聚甲醛在蒸馏水中的4％PFA）通过泵。允许在4％PFA通过动物泵为大约8-10分钟（300毫升）中。逐渐增加，达到一最大30毫升/分钟的压力。一个硬化的肝脏是一个成功灌注的最佳适应证。

10.组织收集和处理，组织学和Iimmunohistochemistry

1. 解剖脊髓从T5到L1。然后后修复组织的6ml在4％PFA（O / N，4℃）。
2. 把相同的组织中，在4℃下，用30％的蔗糖的溶液72小时，以冷冻保护它，并防止在冷冻过程中晶体的形成。
3. 用干冰迅速冷冻的线，并将其存储在-80℃。
4. 用15微米厚的低温恒温器的方式部分和收集部分到玻片上，继续进行免疫。
5. 冲洗切片用200μl的PBS各S立德（3次;每次5分钟，RT）。
6. 透每个幻灯片用200μl的10％NGS和0.2％的Triton X-100的PBS中进行1小时，在室温。
7. 冲洗用200微升PBS每张幻灯片（3次;每次5分钟，RT）的部分。
8. 阻断非特异性位点用200μl阻断对滑动溶液（5％NGS; 0.1％的Triton X-100的PBS）中30分钟（RT）。
9. 孵育各滑动用200μl初级抗体O / N的在4℃下（稀抗体在5％NGS;在PBS中的0.1％的Triton X-100）。
10. 用200μlPBS中的每个滑动洗切片（3次;每次5分钟; RT）下。
11. 孵育2小时在RT适当的二级抗体。
12. 用200μlPBS中的每个滑动洗切片（3次;每次5分钟; RT）下。
13. 染色细胞核用200μl的4'，6- diamidin -2- phenilindole吲哚（DAPI）（1μg/ ml的终浓度，在室温下10分钟）。
14. 通过使用FluorSave试剂安装和共聚焦显微镜分析。
    注:在控制测定，初级抗体必须被省略，且具有同等的浓度相同亚类的无关的IgG替换。微管相关蛋白2的第一抗体被使用。

结果

移植的细胞的总数为1×10 ⁶个细胞，并分成三个连续注射在尾静脉。我们在50μl磷酸盐缓冲液（PBS）施用3.3×10 ⁵个细胞。在30分钟内，进行第一次注射损伤后，第二6小时后和病变后的最后18小时。的18小时SCI后一个时限给药PM-NPC的选择通过血脑屏障的渗透性最优，此时¹⁴进行测定。来评价干细胞注射的效果有阳性对照椎板切除术动物将是有用（N = 14）和PBS注射的动物作为阴性?...

讨论

在本文中，我们描述了在70克迪涅（重度）的力的方法来获得外伤性脊髓损伤的可重复使用的模型是无限的地平线撞击。使用较大的力的范例（80克迪涅），我们可能会导致不幸的是具有较高的小鼠的死亡率相关联的更严重的伤害。为了避免这个问题，我们一般选择温和的力量范式（70克迪涅），使用功能和较低的死亡率逐渐复苏关联到一个可重复的病变。为了产生这样的稳定​​损伤是非常重要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC