Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

Resumen

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Resumen

Lesión de la médula espinal es una condición clínica devastadora, caracterizada por un complejo de disfunciones neurológicas. Los modelos animales de lesión de la médula espinal pueden ser utilizados tanto para investigar las respuestas biológicas a la lesión y para probar terapias potenciales. Contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente son los modelos más utilizados de la patología. En este informe, la contusión experimental se lleva a cabo utilizando el dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite la creación de un modelo animal de lesión reproducible través de la definición de los parámetros de lesión específica. El trasplante de células madre es considerada comúnmente una estrategia potencialmente útil para la curación de esta enfermedad debilitante. Numerosos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre. Aquí se demuestra un método adaptado para la lesión de la médula espinal seguida de la inyección de cola vena de células en ratones CD1. En resumen, ofrecemos procedimientos para: i) wi etiquetado celularº un trazador de vital importancia, ii) la atención pre-operatoria de los ratones, iii) la ejecución de una lesión de la médula espinal contundente, y iv) la administración intravenosa de post mortem precursores neuronales. Este modelo contusión puede ser utilizado para evaluar la eficacia y seguridad de trasplante de células madre en un enfoque de la medicina regenerativa.

Introducción

Una lesión de la médula espinal (SCI) es la lesión más común causada por traumatismos de alta energía como vehículos de motor accidentes, caídas, el deporte y la violencia ^1. En grave SCI, la fuerza de la lesión destruye o daña el tejido neural, causando la pérdida repentina de la función neurológica. Traumático SCI se produce con frecuencia en adultos jóvenes de entre 10 y 40 años de edad. Afecta en gran medida la condición mental y física del paciente y causa enorme impacto económico para la sociedad ^2. El enfoque de tratamiento en la fase aguda es a menudo limitada a una dosis alta de corticosteroides, la estabilización quirúrgica y descompresión a la posibilidad de atenuar daño adicional ^3-4, pero las funciones de estos métodos en la recuperación del aparato locomotor después de SCI son aún controversial. Además de la pérdida de tejido agudo, la lesión traumática y la activación de mecanismos secundarios de degeneración causa la desmielinización y muerte de múltiples tipos de células ^5-6. El grado de recuperación de la función puede dediez en proporción con la magnitud de la materia blanca escatimado en el sitio de la lesión ^7.

Los modelos animales de SCI se pueden utilizar tanto para investigar las respuestas biológicas de los tejidos a la lesión y para probar posibles terapias. Por otra parte, un modelo animal útil de una patología humana no sólo tiene que reproducir algunos aspectos de esa condición, pero también debe ofrecer ventajas con respecto a la observación clínica directa y experimento. Los modelos más utilizados de lesión de la médula espinal implican contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente ^8. El desarrollo de una lesión por contusión peso soltar controlado representa un hito importante en la historia de la investigación de SCI. El centro de investigación de la médula espinal Universidad del Estado de Ohio ha perseguido el desafío tecnológico de un dispositivo que se puede utilizar para inducir una compresión particular de la médula espinal con los parámetros de impacto controlados por un ordenador ^9. Este fue originalmente diseñado para el uso wiratas th; más tarde se modificó para aplicar a los ratones ^10. Las ventajas de este tipo de enfoque son que la biomecánica del accidente se pueden estudiar más en profundidad y los parámetros de lesión se pueden definir de una manera más completa con el fin de obtener un modelo experimental reproducible, por lo tanto, permitiendo una evaluación más precisa de los efectos de Los tratamientos probados en el proceso de recuperación funcional.

Muchos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre en modelos SCI ^11. Hemos aislado recientemente adultos neural de células madre a partir de la Sub-Zona ventricular (SVZ) varias horas después de la muerte del donante ratón ^12-13. Este procedimiento proporciona una población de células madre neuronales, llamado post mortem precursores neurales (PM-NPC), que parecen ser ventajoso en un enfoque de la medicina regenerativa para curar SCI. En este artículo vamos a demostrar: i) el protocolo para el etiquetado de células con el PKH26 trazador vitales, ii) la cirugiCal procedimiento para llevar a cabo en SCI traumática, y iii) la administración intravenosa (iv) la administración de células marcadas. Por otra parte, en este trabajo se demuestra que las células trasplantadas migran a sitios de lesión de la médula espinal y se diferencian principalmente en la proteína asociada a los microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Además, la diferenciación está acompañado por la promoción de una recuperación estable de la función de la extremidad posterior.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Revisión de la Universidad de Milán y cumplen las directrices italiana para Animales de Laboratorio en el cumplimiento de la Directiva Europea Comunidades fechado en noviembre de 1986 (86/609 / CEE).

1. Preparación de las células para el trasplante

NOTA: Usar las células madre neuronales entre el quinto y el noveno pasaje en cultivo durante estos experimentos; probar las culturas para la proliferación y capacidad de diferenciación antes de ser etiquetados para el trasplante. Determinar el grado de diferenciación por inmunohisto ^12.

1. Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / 150 l (trasplante de 1 x 10 ⁶ células por ratón). Preparar al menos 1,2 x 10 ⁶ células por ratón porque se requiere un exceso de células para los propósitos de la jeringa de carga.
2. Lavar las células 3 veces con medio de células madre neurales ¹³ en una 10 ml frasco cónico. En cadaetapa de lavado, las células precipitado mediante centrifugación (500 xg durante 5 min, RT).
3. Contar las células antes del centrifugado final.
4. Centrifugar las células (500 xg durante 5 minutos), y luego aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no eliminar cualquier célula pero no dejando más de 25 l de sobrenadante.
5. Preparar una suspensión celular 2x mediante la adición de 1 ml de Diluyente C al sedimento celular y resuspender con pipeteo suave.
6. Inmediatamente antes de la tinción, preparar un colorante de la solución de 2x (4 x ^10-6 M) en diluyente C mediante la adición de 4 l de la solución de colorante PKH26 etanol a 1 ml de Diluyente C en un tubo y mezclar bien para dispersar.
7. Añadir rápidamente el 1 ml de suspensión celular 2x a 1 ml de 2x Solución colorante y mezclar inmediatamente la muestra con la pipeta (densidad celular final será 1,2 x 10 ⁷ células / ml y 2 x ^10-6 M PKH26).
8. Incubar la suspensión de células / tinte de 1-5 min.
9. Detener la tinción mediante la adición de un volumen igual (2ml) de solución de BSA 1% en HBSS y se incuba durante 1 min.
10. Centrifugar las células (500 xg durante 10 minutos) y retire cuidadosamente el sobrenadante.
11. Resuspender pellet de células en 10 ml de HBSS y se centrifuga (500 xg durante 5 min).
12. Lavar el sedimento celular 2 veces más con 10 ml de medio completo para asegurar la eliminación de tinte no unido.
13. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio completo para la evaluación de la recuperación celular, viabilidad celular y la intensidad de fluorescencia. Si se necesitan las células para el trasplante, lavar y resuspender en una solución fisiológica estéril a una concentración de 3,3 x 10 ⁵ células / 50 mL.

2. Preparación para la Cirugía

1. Equipos de cirugía Limpiar y esterilizar.
2. Prepare el área de la cirugía frotando con un agente aséptica. Configure el dispositivo IH impactador.
3. Preparar el equipo de anestesia: el Scavenger Gas activa con VetScav pesaje de filtros de dispositivo, el flujo continuo Cámara de inducción, Gene oxígenorador, Bajo Flujo de _O2 Meter para ratones. Limpie la cámara de inducción y de la máscara utilizada durante la cirugía.
4. Anestesiar a los animales con 2,5% (v / v) isoflurano en oxígeno (1 L / min), y esperar 5 min después de la inducción de flujo para que el fármaco tenga efecto. Compruebe si los bigotes son contracciones o si hay retirada de las extremidades posteriores lento en respuesta a pellizcar la almohadilla plantar. Durante la cirugía, reducir la concentración de isoflurano al 2,0% (v / v) isoflurano en oxígeno (1 L / min).

3. Preparación de ratones de Cirugía y Trasplante

1. Mantenga el macho adulto CD1 ratones (25-30 g) durante al menos 3 días antes de los experimentos en condiciones normales (22 ± 2 ° C, 65% de humedad, y la luz artificial de 08:00 am a 08:00 pm).
   NOTA: Todo el procedimiento de preparación quirúrgica para suturar tomará alrededor de 40 minutos.
   1. Para identificar el animal, marque la cola por medio de tinta de color resistente al agua.
2. Utilice un electric maquinilla para cortar el pelo dorsal del ratón en el cuello, sobre a nivel T2, a la zona lumbar.
3. Esterilizar el área preparada con una solución de yoduro y etanol (70% en agua estéril).
4. Tratar al animal con una inyección subcutánea (sc) de 200 l de gentamicina (1 mg / ml en solución salina estéril).
5. Aplicar lubricante oftálmica para ambos ojos de los animales para evitar la desecación e inyectar buprenorfina (por vía subcutánea, 0,03 mg / kg) para aliviar el dolor.

4. La laminectomía

1. Coloque el ratón sobre un calentador de deslizamiento para evitar el problema de la hipotermia durante la cirugía. Coloque el animal con la cara dorsal hacia arriba.
2. Hacer una incisión vertical con un bisturí sobre la región de interés, a partir de T7 a T12.
3. Mantenga la piel y la almohadilla de grasa superficial mediante el uso de fórceps estándar (normalmente se encuentra en el espacio entre el 5 ^y 6 de los procesos dorsales torácicas).
4. Cuente el proceso bajo el buque como T6luego pasar a T7.
5. Coloque un poco de rodamiento bajo la parte ventral del ratón para aumentar la curvatura de la columna vertebral. Inmovilizar la médula espinal mediante el bloqueo con el fórceps Graefe.
6. Cortar la musculatura paravertebral bilateral de T7 y el nivel vertebral T10 utilizando el bisturí hasta que la superficie dorsal de los contactos de lámina de la punta de bisturí.
7. Utilice el bisturí para marcar la casilla de la unión de T7 hasta T10. Pare en el espacio entre T8 y T9 protuberancias espinosas. Cortar los tejidos entre T8-T9 y T9-T10 con las tijeras micro.
   1. Utilice la Rongeur para eliminar el proceso de T9. Exponga el cruce con cuidado raspar la capa muscular con las tijeras micro. Continúe hasta que se expone el hueso.
8. Utilice las pinzas para eliminar los músculos de la lámina y abrir un pequeño espacio entre las vértebras. Introduzca suavemente las tijeras micro debajo del hueso, cortar la lámina en ambos lados y retirar esta parte con pinzas.
9. Retire la lámina con la forceps para exponer el cable. Asegúrese de no dejar fragmentos óseos libres o irregulares detrás; eliminarlos con la Rongeur.
10. Use las pequeñas pinzas de punta para eliminar el periostio, así como cualquier fragmentos de hueso o músculos que puede estar cerca de la incisión.
11. Retire la mitad superior del proceso dorsal T9 y proceda con el protocolo de dispositivo IH impactador.

5. Protocolo de dispositivos IH Impactor (contusión)

1. Coloque el ratón en el centro de la plataforma de la estabilización del dispositivo IH Impactor.
2. Bloquear el animal con las dos pinzas de dientes conectados con la plataforma de estabilización por dos brazos de posicionamiento conjunta (brazo izquierdo de la vértebra torácica, el brazo derecho de la vértebra cervical).
3. Utilice el brazo rostral de captar el borde lateral del cuerpo vertebral rostral (T8).
4. Manipular el brazo caudal de la misma manera de entender el cuerpo vertebral T10.
5. Coloque la plataforma de estabilización en el dispositivo y reducir la punta (diámetro 0,75mm) lo más cerca posible del cable como sea posible, pero sin tocarlo.
6. Levante la punta tres vueltas completas antes de iniciar el impacto.
7. Realice la contusión con el impactador fijado para suministrar una fuerza de 60 kdyn a 100 mm / seg.

6. Las suturas y Post-cuidado

1. Suturar la incisión con una absorbible hilo de sutura 4/0. Cubrir la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina retirada; suturar el tejido en los extremos de la corte por medio de una aguja pequeña. Poner los dos puntos de sutura inmediatamente por encima y por debajo del sitio de la exposición de la médula espinal.
2. Cierre la piel con dos o tres clips Reflex sin pellizcando los músculos subyacentes.
3. Hidratar el ratón después de la cirugía con 2 ml de solución salina por vía subcutánea inyectados en la espalda baja.
4. Coloque el ratón de nuevo en una jaula pre-calentado para evitar la hipotermia durante la recuperación quirúrgica. Coloque las jaulas en almohadillas térmicas.
5. Monitorear los ratones durante la fase aguda después de la lesión, marcando lavejiga tamaño, la sutura y el peso de los animales dos veces al día. Apriete suavemente la vejiga (dos veces al día durante 7 días) para evitar infecciones del tracto urinario (orina puede ser turbia, tiene sangre o que contenga cualquier precipitado).
6. Tratar los ratones una vez al día con una inyección de solución salina (2 ml por dos días de inyección sc después de la cirugía) y antibióticos (gentamicina 0,2 ml; inyección sc) durante cinco días después de la lesión.
7. Tratar los ratones para la analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,1 mg / kg; dos veces al día) durante 3 días después de la lesión.

7. vena de la cola inyección de células

NOTA: En el siguiente paso se demuestra el procedimiento para la inyección de las células en la vena de la cola. Las células pueden ser también administrados con un trasplante de intraespinal mediante el uso de un marco estereotáxico ^15-16, o en la cisterna magna ^17. Es importante tener en cuenta que otros tipos de células podrían ser trasplantados con este método, tales como las células estromales mesenquimales(por ejemplo, células madre mesenquimales de la médula ósea, células madre derivadas de tejido adiposo, células de líquido amniótico). Además, otras opciones de tratamiento, tales como nanopartículas pueden inyectarse a través de la vena de la cola después de la lesión de la médula espinal.

1. Utilice etanol al 70% y PBS para limpiar la aguja antes de su uso. Manejar la aguja y la jeringa solamente con guantes estériles.
2. Resuspender las células en el tubo de ensayo y la carga de 75 l de células en una jeringuilla de 0,3 ml (29 G aguja y 0,33 cc jeringa).
3. Asegúrese de que no hay burbujas en la suspensión celular. Mantener la jeringa en una posición horizontal para evitar la sedimentación de células.
4. Coloca el ratón debajo de la lámpara de calor para dilatar las venas de la cola.
5. Coge el ratón y tire de él en el limitador del ratón para visualizar la vena lateral de la cola como una línea azul estrecha.
6. Limpie la cola con un algodón empapado en alcohol. Una vez que la vena se visualiza, agarra la vena de la cola entre el dedo medio y el pulgar de la mano izquierda.
7. Lleve la aguja a la superficie en un ángulo de 15 ° desde el horizonte y asegúrese de que el bisel está para arriba.
8. Inyectar 50 l de células a una velocidad de 0,33 l / seg. Después de la inyección, retrasar la retracción de la aguja por 10 seg. Retraer la aguja lentamente y prestar atención a la posible flujo de salida de la suspensión celular.
9. Limpie la jeringa como en el paso 7.1 entre las cargas.

8. Pruebas de comportamiento y función de la extremidad posterior

1. Coloque el ratón en el campo abierto.
2. Evaluar la función locomotora y la recuperación de la extremidad posterior después de la contusión con la prueba de campo abierto según la escala del ratón Basso (BMS) ^18.
   NOTA: La función neurológica debe ser evaluado periódicamente, desde el día 3 después de la lesión durante 4 semanas ^18.

9. perfusión

1. Al final del periodo experimental, anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (65 mg / kg). Utilice pellizcos del dedo del pie de evaluace el nivel de anestesia y proceder sólo después ratón no responde a los estímulos nocivos.
2. Restringir el animal en posición supina sobre un plano de la cirugía.
3. Cortar a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Separar el diafragma desde el hígado.
4. Use las tijeras para cortar el diafragma para exponer la cavidad pleural.
5. Cortar los lados de la caja torácica hasta que los huesos del cuello.
6. Utilice las pinzas para sujetar el cartílago xifoides y coloque la pinza en la cabeza.
7. Sostenga el tercio inferior del corazón en un plano transversal con las pinzas. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo.
8. Use una pinza hemostática para sujetar el corazón. Esto asegura la aguja y evita las fugas.
9. Use las tijeras para cortar la aurícula derecha.
10. Permitir que el PBS a la bomba (18 ml / min) a través del animal. Mantener esta presión durante todo el período de infusión tampón (3-4 min; que corresponde a aproximadamente 70 ml de PBS). Continúe hasta que el corazón está limpio.
11. Cambie la llave de paso para permitir que el fijador (paraformaldehído al 4% en agua destilada, 4% PFA) a través de la bomba. Permitir que el PFA 4% a la bomba a través del animal durante aproximadamente 8-10 min (300 ml). Poco a poco aumentar la presión para llegar a un máximo de 30 ml / min. Un hígado endurecido es la mejor indicación de una perfusión exitosa.

10. Recogida de tejidos y Procesamiento, Histología y Iimmunohistochemistry

1. Diseccionar las médulas espinales de T5 a L1. Entonces después de fijar el tejido en 6 ml de PFA al 4% (O / N a 4 ° C).
2. Ponga el mismo tejido en una solución con 30% de sacarosa durante 72 horas a 4 ° C con el fin de crio protegerlo y para prevenir la formación de cristales durante la congelación.
3. Congelación rápida usando el cable de hielo seco y almacenarlo a -80 ° C.
4. Sección por medio de un criostato con 15 micras de espesor y recoger las secciones en portaobjetos de vidrio y continuar para inmunocitoquímica.
5. Enjuague secciones con 200 l de PBS para cada slide (3 veces; 5 minutos cada uno, RT).
6. Permeabilizar cada portaobjetos con 200 l de 10% NGS y 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hora a RT.
7. Enjuague secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces; 5 min cada uno, RT).
8. Bloquear los sitios no específicos con 200 l de solución de bloqueo durante corredera (5% NGS; 0,1% Triton X-100 en PBS) durante 30 min (RT).
9. Incubar cada portaobjetos con 200 l de anticuerpos primarios O / N a 4 ° C (diluir anticuerpos en 5% NGS; 0,1% Triton X-100 en PBS).
10. Lávese las secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces, 5 minutos cada uno; RT).
11. Incubar con anticuerpos secundarios apropiados durante 2 horas a RT.
12. Lávese las secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces, 5 minutos cada uno; RT).
13. Núcleos se tiñen con 200 l de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 mg / ml de concentración final, 10 min a RT).
14. Montar utilizando el Fluorsave Reactivo y analizar por microscopía confocal.
    NOTA: Endeterminaciones de control, anticuerpos primarios deben suprimirse y reemplazarse con concentraciones equivalentes de IgG no relacionado de la misma subclase. Se utilizó proteína 2 de anticuerpos primaria asociada a los microtúbulos.

Resultados

El número total de células trasplantadas es 1 x 10 ⁶ células y se dividió en tres inyecciones consecutivas en la vena de la cola. Se administraron 3,3 x 10 ⁵ células en 50 l de solución tampón de fosfato (PBS). La primera inyección se realizó dentro de 30 min después de la lesión, el segundo 6 horas más tarde y el último 18 h después de la lesión. La elección de un plazo de 18 horas después de la lesión de la administración de PM-NPC se determinó por la permeabilidad óptima de ...

Discusión

En este trabajo se describe un método para obtener un modelo reproducible de lesión medular traumática utilizando un infinito horizonte Impactor con una fuerza de 70 Kdyne (grave). El uso de un paradigma de fuerza mayor (80 Kdyne), podemos causar una lesión más grave que por desgracia está asociada con la mortalidad ratones superiores. A fin de evitar este problema, que comúnmente escogemos un paradigma de fuerza moderada (70 Kdyne) que está asociado a una lesión repetible con una recuperación gradual de la fu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC