Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Résumé

Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d'une transplantation de cellules souches neurales.

Résumé

Lésion de la moelle épinière est un état clinique dévastateur, caractérisé par un complexe de dysfonctionnements neurologiques. Les modèles animaux de lésions de la moelle épinière peuvent être utilisés à la fois pour enquêter sur les réponses biologiques à des blessures et de tester des thérapies potentielles. Contusion ou compression délivrée blessure à la moelle épinière exposée chirurgicalement sont les modèles les plus répandus de la pathologie. Dans ce rapport, la contusion expérimentale est effectuée en utilisant l'horizon infini (IH) dispositif de Impactor, qui permet la création d'un modèle animal de lésion reproductible par la définition des paramètres de blessures spécifiques. la transplantation de cellules souches est généralement considérée comme une stratégie potentiellement utile pour guérir cette maladie débilitante. De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation de diverses cellules souches. Ici, nous démontrons une méthode adaptée pour les blessures de la moelle épinière suivie par injection dans la veine de la queue de cellules dans des souris CD1. En bref, nous fournissons les procédures pour: i) le marquage cellulaire wie un traceur vitale, ii) soins pré-opératoires de souris, iii) l'exécution d'une blessure de la moelle épinière contondante, et iv) l'administration intraveineuse de post mortem précurseurs neuraux. Ce modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l'efficacité et l'innocuité de la transplantation de cellules souches dans une approche de la médecine régénératrice.

Introduction

Une blessure de la moelle épinière (SCI) est la blessure la plus courante causée par un traumatisme à haute énergie comme les véhicules automobiles accidents, les chutes, les sports et la violence ^1. En graves SCI, la force des blessures détruit ou endommage les tissus nerveux, causant une perte soudaine de la fonction neurologique. Traumatique SCI se produit fréquemment chez les jeunes adultes entre 10 et 40 ans. Il affecte grandement état ​​mental et physique du patient et provoque un énorme impact économique pour la société ^2. L'approche de traitement à la phase aiguë est souvent limitée à une forte dose de corticostéroïdes, la stabilisation et la décompression chirurgicale pour atténuer éventuellement d'autres dommages ^3-4, mais les rôles de ces méthodes sur la récupération locomotrice après SCI sont encore controversée. En plus de la perte de tissu aigu, la lésion traumatique et l'activation des mécanismes secondaires causes de la dégénérescence et de la mort démyélinisation de plusieurs types de cellules ^6.5. Le degré de récupération de la fonction peut dedix être corrélée à la mesure de la substance blanche ménagé au site de la lésion ^7.

Les modèles animaux de SCI peuvent être utilisés à la fois pour étudier les réponses biologiques des tissus à des blessures et de tester des thérapies potentielles. En outre, un modèle animal utile d'une pathologie humaine a non seulement de reproduire certains aspects de cette condition, mais aussi doit offrir des avantages plus de l'observation clinique directe et expérience. Les modèles les plus largement utilisés de blessures de la moelle épinière impliquent une contusion ou une compression des blessures livré à la moelle épinière exposé chirurgicalement ^8. Le développement d'une blessure contusion poids baisse contrôlée représente un jalon important dans l'histoire de la recherche SCI. Le centre de recherche sur la moelle épinière Ohio State University a poursuivi le défi technologique d'un dispositif qui peut être utilisé pour induire une compression particulière de la moelle épinière avec des paramètres d'impact contrôlées par un ordinateur ^neuf. Cela a été initialement conçu pour une utilisation wie rats; plus tard, il a été modifié pour se appliquer à ¹⁰ souris. Les avantages de ce type d'approche sont que les biomécanique de blessures peuvent être étudiés plus en profondeur et les paramètres de blessures peuvent être définis d'une manière plus complète afin d'obtenir un modèle expérimental reproductible, permettant ainsi une évaluation plus précise des effets de traitements testés sur le processus de récupération fonctionnelle.

De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation d'une variété de cellules souches dans des modèles ¹¹ SCI. Nous avons récemment isolé adultes de neurones cellules souches de la zone sous-ventriculaire (SVZ) plusieurs heures après la mort du donneur de la souris ^12-13. Cette procédure prévoit une population de cellules souches neurales, appelé après mortem précurseurs neuraux (PM-PNJ), qui semblent être avantageux dans une approche de la médecine régénérative pour guérir SCI. Dans cet article nous allons le démontrer: i) le protocole de marquage des cellules avec le traceur PKH26 vitale, ii) l'Surgical procédure à effectuer sur lésions médullaires traumatiques, et iii) la voie intraveineuse (iv) l'administration de cellules marquées. En outre, dans ce travail, nous démontrons que les cellules transplantées migrent vers les sites de lésion de la moelle épinière et se différencient principalement en protéines associée aux microtubules (MAP) 2 cellules positives. De plus, la différenciation se accompagne de la promotion d'une récupération stable de la fonction des membres postérieurs.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'examen de l'Université de Milan et ont rencontré les directeurs italiens pour les animaux de laboratoire en conformité avec la directive européenne du Communautés Novembre 1986 (86/609 / CEE).

1. Préparation des cellules destinés à la transplantation

REMARQUE: utiliser des cellules souches neurales entre le 5e et le 9e passage en culture de ces expériences; tester les cultures pour la prolifération et la capacité de différenciation avant d'être marqué pour la transplantation. Déterminer le degré de différenciation par immunocytochimie ^12.

1. Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / 150 ul (1 transplantation x 10 ⁶ cellules par souris). Préparer au moins 1,2 x 10 ⁶ cellules par souris, car un excès de cellules est nécessaire à des fins seringue de chargement.
2. Laver les cellules trois fois en utilisant un milieu de cellules souches neurales ¹³ dans une fiole conique de 10 ml. Dans chaqueétape de lavage, les cellules précipitées par centrifugation (500 g pendant 5 min, RT).
3. Compter les cellules avant l'essorage final.
4. Centrifuger les cellules (500 g pendant 5 min), puis aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas enlever les cellules, mais ne laissant pas plus de 25 pi de surnageant.
5. Préparer une suspension de cellules 2x par addition de 1 ml de diluant C au culot de cellules et remettre en suspension avec pipetage doux.
6. Immédiatement avant la coloration, préparer une solution de colorant 2x (4 x ^10-6 M) dans le diluant C par addition de 4 ul de la solution de colorant PKH26 d'éthanol à 1 ml de diluant C dans un tube et mélangez bien se disperser.
7. Ajoutez rapidement les 1 ml de 2x suspension de cellules à 1 ml de 2x Dye Solution et immédiatement mélanger l'échantillon par pipetage (densité cellulaire finale sera 1,2 x 10 ⁷ cellules / ml et 2 x ^10-6 M PKH26).
8. Incuber la suspension de cellules / colorant 1-5 min.
9. Arrêter la coloration par addition d'un volume égal (2ml) de solution de BSA à 1% dans du HBSS et incuber pendant 1 min.
10. Centrifuger les cellules (500 g pendant 10 min) et retirer délicatement le surnageant.
11. Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de HBSS et centrifugation (500 g pendant 5 min).
12. Laver le culot de cellules deux fois de plus avec 10 ml de milieu complet pour assurer l'élimination de colorant non fixé.
13. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu complet à l'évaluation de la récupération des cellules, la viabilité des cellules et l'intensité de fluorescence. Si les cellules sont nécessaires pour la transplantation, laver et remettre en suspension dans une solution physiologique stérile à une concentration de 3,3 x 10 ⁵ cellules / 50 ul.

2. Préparation pour l'intervention

1. Équipements de chirurgie nettoyer et stériliser.
2. Préparer la zone de la chirurgie en essuyant avec un agent aseptique. Mettre en place le dispositif IH Impactor.
3. Préparer le matériel d'anesthésie: le trésor de gaz actif avec VetScav Pesage du filtre de périphérique, flux continu Chambre induction, Gene d'oxygènerateur, faible débit O ₂ mètres pour les souris. Nettoyer la chambre d'induction et le masque utilisé pendant la chirurgie.
4. Anesthésier animaux avec 2,5% (v / v) l'isoflurane en oxygène (1 L / min), et attendre 5 min après l'induction de l'écoulement de la drogue prenne effet. Vérifiez si les moustaches sont des contractions musculaires ou se il est lent retrait des membres postérieurs en réponse à pincer le coussinet plantaire. Au cours de la chirurgie, de réduire la concentration d'isoflurane à 2,0% (v / v) d'isoflurane dans de l'oxygène (1 litre / min).

3. Préparation de souris pour la chirurgie et la transplantation

1. Gardez le mâle adulte CD1 souris (25-30 g) pendant au moins trois jours avant les expériences dans des conditions standard (22 ± 2 ° C, 65% d'humidité et de lumière artificielle entre 08h00-20h00).
   NOTE: L'ensemble de la procédure de la préparation chirurgicale pour suture prendra environ 40 minutes.
   1. Pour identifier l'animal, marquer la queue au moyen d'eau encre de couleur résistante.
2. Utilisez un électric tondeuse pour couper les cheveux dorsale de la souris à partir du col, environ au niveau de T2, de la région lombaire.
3. Stériliser la zone préparée avec une solution d'iodure et de l'éthanol (70% dans l'eau stérile).
4. Traiter l'animal avec un sous cutanée (sc) injection de 200 ul de la gentamycine (1 mg / ml dans une solution saline stérile).
5. Appliquer du lubrifiant ophtalmique aux deux yeux d'animaux pour éviter la dessiccation et injecter de la buprénorphine (sous-cutanée, 0,03 mg / kg) pour soulager la douleur.

4. laminectomie

1. Passer la souris sur une plus chaud de glissement pour éviter le problème de l'hypothermie pendant la chirurgie. Placez l'animal avec la dorsale vers le haut.
2. Faire une incision verticale avec un scalpel sur la région d'intérêt, à partir de T7 à T12.
3. Maintenez la peau et un tampon de graisse superficielle en utilisant une pince standards (généralement situé dans l'espace entre la 5 ^ème et 6 ^ème processus dorsales thoraciques).
4. Comptez le processus sous le navire comme T6puis passer à T7.
5. Placer un peu d'incidence sous la face ventrale de la souris pour augmenter la courbure de la colonne vertébrale. Immobiliser la moelle épinière en le bloquant avec la pince Graefe.
6. Couper les muscles paravertébraux bilatéralement à partir de T7 et T10 niveau vertébral en utilisant le scalpel jusqu'à ce que la surface dorsale des contacts de la lamina de pointe de scalpel.
7. Utilisez le scalpel pour cocher la jonction de T7 jusqu'à T10. Arrêtez-vous dans l'espace entre T8 et T9 saillies épineuses. Couper les tissus entre T8-T9 et T9-T10 avec les ciseaux micro.
   1. Utilisez le Rongeur de retirer le processus de T9. Exposer la jonction par attentivement raclant la couche musculaire avec les ciseaux micro. Continuez jusqu'à ce que l'os est exposé.
8. Utilisez la pince pour retirer les muscles de la lamina et ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Insérez délicatement les ciseaux micro sous l'os, couper la lame sur les deux côtés et enlever cette partie avec une pince.
9. Retirez la lame avec le forceps pour exposer le cordon. Veillez à ne pas laisser des fragments d'os gratuits ou déchiquetés derrière; retirez-les avec le Rongeur.
10. Utilisez les petites pinces d'extrémité pour retirer le périoste ainsi que les fragments d'os ou des muscles qui peuvent être près de l'incision.
11. Retirer la moitié supérieure du processus de dorsale T9 et procéder au protocole de l'appareil IH Impactor.

5. Protocole de périphériques IH Impactor (contusion)

1. Placer la souris dans le milieu de la plate-forme de stabilisation de l'appareil impacteur IH.
2. Bloquer l'animal avec les deux dents des pinces liées à la plate-forme de stabilisation par deux bras de positionnement commun (bras gauche de la vertèbre thoracique, le bras droit pour vertèbre cervicale).
3. Utilisez le bras rostrale à saisir le bord latéral du corps vertébral rostrale (T8).
4. Manipuler le bras caudale de la même manière à saisir le corps vertébral de T10.
5. Placez la plate-forme de stabilisation dans l'appareil et réduire la pointe (diamètre 0,75mm) aussi près que possible le câble sans le toucher.
6. Soulevez la pointe trois tours complets avant de lancer l'impact.
7. Effectuer la contusion avec l'impacteur réglé pour fournir une force de 60 à 100 mm Kdyn / sec.

6. Les sutures et les soins post-

1. Suturer l'incision avec un fil de suture absorbable 4/0. Couvrir la moelle épinière exposée à l'endroit de la lame enlevée; suturer le tissu aux extrémités de la coupe au moyen d'une petite aiguille. Mettre les deux points ci-dessus et immédiatement sous le site de l'exposition de la moelle épinière.
2. Fermez la peau à l'aide de deux ou trois clips Reflex sans pincement au large des muscles sous-jacents.
3. Hydrater le post-opératoire de la souris avec 2 ml de solution saline injection sous-cutanée dans le bas du dos.
4. Placez la souris dans une cage retour préchauffé pour éviter l'hypothermie pendant la reprise chirurgicale. La place des cages sur des coussins chauffants.
5. Surveiller les souris au cours de la post-traumatique de la phase aiguë en cochant lataille de la vessie, le fil de suture et le poids de l'animal deux fois par jour. Pressez délicatement la vessie (deux fois par jour pendant 7 jours) pour éviter les infections (l'urine pourrait être nuageux, sanglante ou contenant des précipités) de l'appareil urinaire.
6. Traiter les souris une fois par jour avec une injection de solution saline (2 ml pendant deux jours d'injection sc post-chirurgie) et antibiotique (gentamicine 0,2 ml; injection sc) pendant cinq jours après la lésion.
7. Traiter les souris pour l'analgésie post-opératoire avec la buprénorphine (0,1 mg / kg; deux fois par jour) pendant 3 jours après la lésion.

7. veine caudale injection de cellules

REMARQUE: Dans l'étape suivante de la procédure de l'injection des cellules dans la veine caudale est démontrée. Les cellules peuvent également être administrés avec une greffe intraspinale en utilisant un cadre stéréotaxique ^{15 à 16,} ou dans la cisterna magna ^17. Il est important de noter que d'autres types de cellules ont pu être transplantées avec ce procédé, telles que les cellules stromales mésenchymales(par exemple, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules souches d'origine adipeuse, des cellules de liquide amniotique). En outre, d'autres options de traitement telles que les nanoparticules peuvent être injectés dans la veine caudale après la blessure de la moelle épinière.

1. Utilisez 70% d'éthanol et PBS pour nettoyer l'aiguille avant utilisation. Manipulez l'aiguille et la seringue uniquement avec des gants stériles.
2. Resuspendre les cellules dans le tube et la charge 75 pi de cellules de test dans une seringue 0,3 ml (29 aiguille G et 0,33 cc seringue).
3. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes au sein de la suspension cellulaire. Conserver la seringue en position horizontale pour éviter la sédimentation des cellules.
4. Placez la souris sous la lampe chauffante pour dilater les veines de la queue.
5. Prenez la souris et tirez-le doucement dans le dispositif de retenue de la souris pour visualiser la veine de la queue latérale par une ligne bleue étroite.
6. Nettoyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Une fois la veine est visualisée, saisir la veine de la queue entre le majeur et le pouce de la main gauche.
7. Apportez de l'aiguille à la surface à un angle de 15 ° de l'horizon et se assurer que le biseau est écoulé.
8. Injecter 50 ul de cellules à un débit de 0,33 pl / s. Après l'injection, retarder le retrait de l'aiguille de 10 sec. Rétracter l'aiguille lentement et prêter attention à la possible efflux de suspension cellulaire.
9. Nettoyez la seringue comme dans l'étape 7.1 entre les charges.

8. tests comportementaux et Hind Limb Fonction

1. Placez la souris dans le champ ouvert.
2. Évaluer la fonction locomotrice et la récupération de membre postérieur après une contusion à l'essai en plein champ selon l'échelle de la souris Basso (BMS) ^18.
   NOTE: La fonction neurologique doit être évaluée périodiquement, à partir de 3 jours après la blessure pour 4 semaines ^18.

9. Perfusion

1. A la fin de la période expérimentale, anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de pentobarbital sodique (65 mg / kg). Utilisez pincées d'orteil à évaluate niveau de l'anesthésie et de procéder seulement après la souris ne répond pas aux stimuli nocifs.
2. Retenir l'animal dans une position couchée sur un plan chirurgical.
3. Couper à travers le tégument et la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique. On sépare la membrane du foie.
4. Utilisez les ciseaux pour couper la membrane pour exposer la cavité pleurale.
5. Couper les côtés de la cage thoracique jusqu'à ce que les clavicules.
6. Utilisez les pinces hémostatiques pour serrer le cartilage xiphoïde et placez la pince hémostatique sur la tête.
7. Maintenez le tiers inférieur du cœur sur un plan transversal avec la pince. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche.
8. Utilisez une pince hémostatique pour serrer le cœur. Cela garantit l'aiguille et empêche les fuites.
9. Utilisez les ciseaux pour couper l'oreillette droite.
10. Laisser le PBS à pompe (18 ml / min) par l'animal. Maintenir cette pression pendant toute la période de perfusion de tampon (3-4 min, ce qui correspond à environ 70 ml de PBS). Continuez jusqu'à ce que le cœur est propre.
11. Mettre le robinet d'arrêt pour permettre le fixateur (paraformaldehyde à 4% dans l'eau distillée, 4% PFA) à travers la pompe. Laisser le PFA 4% à pomper par l'animal pendant environ 8-10 min (300 ml). Augmenter progressivement la pression pour atteindre un maximum de 30 ml / min. Un foie durci est la meilleure indication d'une perfusion de succès.

10. Collecte et traitement des tissus, l'histologie et Iimmunohistochemistry

1. Disséquer la moelle épinière de T5 à L1. Puis post-fixer le tissu dans 6 ml dans 4% PFA (O / N à 4 ° C).
2. Mettre le même tissu dans une solution à 30% de saccharose pendant 72 heures à 4 ° C afin de le protéger et cryo pour empêcher la formation de cristaux pendant la congélation.
3. QUICK FREEZE le cordon avec de la glace sèche et le stocker à -80 ° C.
4. L'article au moyen d'un cryostat à une épaisseur de 15 um et collecter les sections sur des lames de verre et continuer à immunocytochimie.
5. Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque slide (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT).
6. Perméabiliser chaque lame avec 200 ul de 10% de NGS et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante.
7. Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque lame (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT).
8. Bloquer les sites non spécifiques avec 200 ul de solution de blocage de coulisseau (5%; NGS 0,1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 30 min (RT).
9. Incuber chaque lame avec 200 ul d'anticorps primaires O / N à 4 ° C (anticorps diluer dans 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 dans du PBS).
10. Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT).
11. Incuber avec des anticorps secondaires appropriés pendant 2 heures à température ambiante.
12. Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT).
13. noyaux de tache avec 200 ul de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentration finale, 10 minutes à température ambiante).
14. Monter en utilisant le réactif FluorSave et analyser par microscopie confocale.
    NOTE: Dansdéterminations de contrôle, des anticorps primaires doivent être supprimées et remplacées avec des concentrations équivalentes de IgG non liée de la même sous-classe. Protein deux anticorps primaire associée aux microtubules a été utilisé.

Résultats

Le nombre total de cellules transplantées est 1 x 10 ⁶ cellules et a été divisé en trois injections consécutives dans la veine de la queue. Nous avons administré 3,3 x 10 ⁵ cellules dans 50 ul de solution tampon de phosphate (PBS). La première injection a été réalisée dans les 30 minutes après la blessure, la deuxième 6 heures plus tard et les dernières 18 heures après la lésion. Le choix d'un délai de 18 h après l'administration de SCI PM-NPC a été déterminée par la p...

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit une méthode pour obtenir un modèle reproductible de blessures de la moelle épinière en utilisant un impacteur Horizon Infini à une force de 70 Kdyne (sévère). En utilisant une force plus importante paradigme (80 Kdyne), nous pouvons causer une blessure plus grave que, malheureusement, est associée à une mortalité des souris élevées. Afin d'éviter ce problème, nous choisissons généralement un paradigme de force modérée (70 Kdyne) qui est associée à une lésion ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC