השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

Summary

פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.

Abstract

פגיעה בחוט השדרה היא מצב קליני הרסני, המתאפיין בחוסר תפקוד נוירולוגים מורכב של. מודלים של בעלי החיים של פגיעה בחוט השדרה יכולים לשמש גם כדי לחקור את התגובות הביולוגיות לפציעה ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. פציעת חבלה או דחיסה נמסרה לחוט השדרה החשוף בניתוח הן המודלים הנפוצים ביותר של פתולוגיה. בדוח זה החבלה הניסיונית מתבצעת על ידי שימוש במכשיר Impactor Infinite האופק (IH), המאפשר יצירה של מודל חיה פגיעה לשחזור באמצעות הגדרה של פרמטרים פציעה ספציפיים. השתלת תאי גזע נחשבת בדרך כלל אסטרטגיה שעשוי להיות שימושית עבור ריפוי מצב המתיש הזה. מחקרים רבים בדקו את ההשפעות של השתלת מגוון של תאי גזע. כאן אנו מדגימים שיטה מותאמת לפגיעה בחוט השדרה ואחרי הזרקה לוריד זנב של תאים בעכברי CD1. בקיצור, אנו מספקים הליכים ל: i) wi תיוג תאה נותב חיוני, ii) לטיפול טרום ניתוחי של עכברים, iii ביצוע) של פגיעה בחוט השדרה contusive, וiv) עירוי לוריד של נתיחה שלאחר מות מבשרים עצביים. מודל חבלה זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את היעילות ובטיחות של השתלת תאי גזע בגישת רפואת רגנרטיבית.

Introduction

פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא הפציעה השכיחה ביותר הנגרמת על ידי טראומת אנרגיה גבוהה כמו תאונות כלי רכב, נופלת, ספורט ואלימות ^1. בSCI החמור, כוח הפציעה הורס או נזקי רקמה עצבית, גורם לאובדן פתאומי של תפקוד נוירולוגים. SCI הטראומתי מתרחש לעתים קרובות במבוגרים צעירים בין 10 ל 40 שנים של גיל. זה מאוד משפיע על מצבו הנפשי והפיזי של המטופל וגורם להשפעה כלכלית עצומה לחברה ^2. גישת הטיפול בשלב האקוטי היא לעתים קרובות מוגבלת למינון גבוה של סטרואידים, ייצוב כירורגי ופריסה אולי כדי להחליש נזק נוסף ^3-4, אבל התפקידים של שיטות אלה על ההתאוששות של תנועה לאחר SCI עדיין שנויים במחלוקת. בנוסף לאובדן חריף רקמה, פגיעה הטראומטית וההפעלה של מנגנונים משניים של demyelination ניוון הסיבה ומוות של סוגי תאים מרובים ^5-6. התאוששות המסוימת של פונקציה יכולה שלעשר להיות מתואמים בהיקף של חומר לבן חסך באתר הפציעה ^7.

מודלים של בעלי החיים של SCI עשויים לשמש גם כדי לחקור את התגובות הביולוגיות של הרקמות לפציעה ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. יתר על כן, מודל חיה שימושי של הפתולוגיה אנושית לא רק לשחזר כמה היבטים של מצב זה, אלא גם חייב להציע יתרונות על פני תצפית קלינית ישירה וניסוי. המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה בחוט השדרה כרוכה פציעת חבלה או דחיסה נמסרה לחוט השדרה החשוף בניתוח ^8. הפיתוח של פגיעת חבלת ירידה במשקל מבוקרת מייצג אבן דרך חשובה בהיסטוריה של מחקר SCI. מרכז מחקר חוט השדרה אוניברסיטת אוהיו רדף האתגר הטכנולוגי של מכשיר שיכול לשמש כדי לגרום דחיסה מסוימת של חוט השדרה עם פרמטרים של השפעה נשלטו על ידי מחשב ^9. זה תוכנן במקור לשימוש wiחולדות ה; מאוחר יותר הוא שונה להחיל כלפי עכברים ^10. יתרונותיה של גישה מסוג זה הם שביומכניקה של פציעה ניתן ללמוד יותר לעומק ואת הפרמטרים של פגיעה יכולים להיות מוגדרים באופן מלא יותר על מנת להשיג מודל ניסיוני לשחזור, ולכן מאפשר הערכה מדויקת יותר של ההשפעות של טיפולים נבדקו על תהליך ההחלמה התפקודי.

מחקרים רבים בדקו את השפעות ההשתלה של מגוון רחב של תאי גזע בדגמי SCI ^11. יש לנו לאחרונה מבודד תאי גזע בוגרים עצביים מהאזור תת-חדרית (SVZ) כמה שעות לאחר מותו של תורם עכבר ^12-13. הליך זה מספק אוכלוסייה של תאי גזע עצביים, מבשרים עצביים הנקרא נתיחה שלאחר המוות (PM-NPCs), נראים שכדי להיות יתרון בגישת רפואת רגנרטיבית בריפוי SCI. במאמר זה נדגים: i) הפרוטוקול לתיוג תא עם PKH26 נותב החיוני, ii) Surgהליך iCal לבצע על SCI הטראומתי, וiii) (iv) העירוי לוריד של תאים שכותרתו. יתר על כן, בעבודה זו אנו מראים כי תאים מושתלים להגר לאתרי נגע חוט השדרה ולהבדיל בעיקר לחלבון microtubule קשור (MAP) 2 תאים חיוביים. יתר על כן, ההבחנה מלווה בקידום התאוששות יציבה של פונקצית גפיים אחוריות.

Protocol

הערה: כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הביקורת של אוניברסיטת מילאנו ונפגשו הנחיות איטלקיות לחיות מעבדה בעמידה בנובמבר אירופאית קהילות הוראה מיום 1986 (86/609 / EEC).

1. הכנת תאים להשתלה

הערה: שימוש בתאי גזע עצביים בין ה -5 וה -9 במעבר תרבות לניסויים אלה; לבדוק את התרבויות לשגשוג ויכולת בידול לפני שכותרתו להשתלה. לקבוע את מידת הבידול על ידי immunocytochemistry ^12.

1. תאי Resuspend בריכוז של 1 10 ⁶ תאים / μl 150 x (השתלת 1 x 10 ⁶ תאים לכל עכבר). הכן לפחות 1.2 x 10 ⁶ תאים לכל עכבר בגלל עודף של תאים אשר נדרש לצורך טעינת מזרק.
2. לשטוף את תאים 3 פעמים באמצעות מדיום בתאי גזע עצבי ¹³ בבקבוקון חרוטי 10 מיליליטר. בכל אחדצעד כביסה, תאי משקע על ידי צנטריפוגה (דקות XG 500 עבור 5, RT).
3. ספירת התאים לפני הסיבוב האחרון.
4. צנטריפוגה התאים (XG 500 במשך 5 דקות), ואז לשאוב supernatant, נזהר שלא להסיר את כל תאים אבל לא משאיר יותר מ -25 μl של supernatant.
5. הכן השעיה תא 2x על ידי הוספת 1 מיליליטר של diluent לג 'לתא גלולה וגלול עם pipetting העדין.
6. מייד לפני הצביעה, להכין 2x Dye פתרון (4 x ^10-6 M) בdiluent לC על ידי הוספת 4 μl של הפתרון לצבוע אתנול PKH26 עד 1 מיליליטר של diluent לC בצינור ומערבבים היטב לפיזור.
7. במהירות להוסיף 1 מיליליטר של השעיה תא 2x ל 1 מיליליטר של 2x Dye פתרון ומייד לערבב המדגם ידי pipetting (צפיפות תאים סופית יהיו 1.2 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר ו -2 x ^10-6 M PKH26).
8. דגירה ההשעיה תא / צבע של 1-5 דקות.
9. לעצור את ההכתמה על ידי הוספת נפח שווה (2מיליליטר) של 1% פתרון BSA בHBSS ו דגירה דקות 1.
10. תאי צנטריפוגה (XG 500 עבור 10 דקות) ולהסיר את supernatant בזהירות.
11. גלולה תא הגלול ב 10 מיליליטר של HBSS ו צנטריפוגות (XG 500 במשך 5 דקות).
12. שטוף את התא גלולה פי 2 עם 10 מיליליטר של מדיום שלם על מנת להבטיח הסרה של צבע מאוגד.
13. Resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום מלא להערכה של התאוששות תא, כדאיות תא ועוצמת הקרינה. אם תאים נדרשים להשתלה, לשטוף וresuspend אותם בפתרון פיסיולוגי סטרילי בריכוז של 3.3 x 10 ⁵ תאים / μl 50.

2. הכנה לניתוח

1. ציוד ניתוח נקי ולעקר.
2. הכן את אזור הניתוח על ידי מנגב עם סוכן aseptic. הגדר את מכשיר IH Impactor.
3. הכן את ציוד הרדמה: זבל הגז פעיל עם מסנן VetScav משקל מכשיר, זרימה רציפה אינדוקציה קאמרית, ג'ין החמצןrator, נמוך זרימה O ₂ מטר לעכברים. נקה את חדר האינדוקציה ומסכה המשמשת במהלך ניתוח.
4. להרדים בעלי חיים עם 2.5% (V / V) isoflurane בחמצן (1 ליטר / דקה), והמתן 5 דקות לאחר זרימת האינדוקציה לתרופה תיכנס לתוקף. בדקו אם השפם הם מתעוות או אם יש נסיגה איטית אחורית איבר בתגובה לצובטים את השודד. במהלך הניתוח, להפחית את הריכוז isoflurane ל -2.0% (V / V) isoflurane בחמצן (1 ליטר / דקה).

3. הכנת עכברים לכירורגיה והשתלות

1. שמור את העכברים בוגרים ממין זכר CD1 (25-30 גרם) במשך לפחות 3 ימים לפני הניסויים בתנאים סטנדרטיים (22 ± 2 ° C, 65% לחות, ואור מלאכותי בין 8:00-08:00).
   הערה: כל ההליך מהכנה כירורגית לתפירה ייקח בערך 40 דקות.
   1. כדי לזהות את בעלי החיים, לסמן את הזנב באמצעות דיו צבעוני עמיד במים.
2. השתמש בחשמלגוזז ic לחתוך את שיער הגב של העכבר מהצוואר, על ברמת T2, לאזור המותני.
3. לחטא את האזור מוכן עם פתרון ואתנול (70% במים סטריליים) יודיד.
4. פנק את החיה עם הזרקה עורית משנה (sc) של 200 μl gentamycin (1 מ"ג / מיליליטר בתמיסת מלח סטרילית).
5. החל סיכה עיניים לשתי עיניים של בעלי החיים כדי למנוע התייבשות ולהזריק עצירות (תת-עורית, 0.03 מ"ג / קילוגרם) כדי להקל על כאב.

4. Laminectomy

1. הנח את העכבר על חם שקופית כדי למנוע את הבעיה של היפותרמיה במהלך הניתוח. מקם את החיה עם הצד עד הגב.
2. לעשות חתך אנכי עם אזמל על האזור של עניין, מT7 לT12.
3. את העור וכרית שומן שטחי באמצעות מלקחיים סטנדרטיים (בדרך כלל נמצא במרחב שבין ^ה -5 וב -6 ^ה תהליכי גב חזה).
4. לספור את התהליך תחת הכלי כפי T6לאחר מכן לעבור לT7.
5. מניחים מעט נושאת תחת הצד הגחוני של העכבר כדי להגדיל את העקמומיות של עמוד השדרה. לשתק את חוט השדרה על ידי חסימה אותו עם המלקחיים גרפו.
6. חותך את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה בילטרלי מT7 ורמת חוליות T10 באמצעות האזמל עד פני השטח הגב של אנשי קשר lamina קצה האזמל.
7. השתמש באזמל כדי לתקתק את הצומת מT7 עד T10. עצור במרחב שבין T8 ובליטות קוצניים T9. חותך את הרקמות בין T8-T9 וT9-T10 עם המספריים מיקרו.
   1. השתמש בRongeur להסיר את תהליך T9. לחשוף את הצומת על ידי גירוד משם בזהירות את שכבת השריר עם המספריים מיקרו. המשך עד העצם חשוף.
8. השתמש במלקחיים כדי להסיר את השרירים מlamina ולפתוח חלל קטן בין החוליות. הכנס בעדינות את המספריים מיקרו תחת העצם, לחתוך את lamina משני הצדדים ולהסיר את החלק הזה עם מלקחיים.
9. הסר את lamina עם forceps לחשוף את הכבל. הקפד לא להשאיר שום שברי עצמות חינם או משוננים מאחור; להסיר אותם עם Rongeur.
10. השתמש במלקחי טיפ הקטנים כדי להסיר את קרום העצם וכן כל שברי עצמות או שרירים שעלולות להיות ליד החתך.
11. הסר את החלק העליון של גב תהליך T9 ולהמשיך לפרוטוקול מכשיר IH Impactor.

5. פרוטוקול Device IH Impactor (חבלה)

1. מניחים את העכבר באמצע פלטפורמת הייצוב של מכשיר IH Impactor.
2. לחסום את החיה עם שני מלקחיים שיניים הקשורים לפלטפורמת הייצוב על ידי שתי זרועות משותפת מיצוב (יד שמאל לחולית בית החזה, יד ימין לחוליית צוואר).
3. השתמש בזרוע מקורי כדי לתפוס את הקצה לרוחב של הגוף מקורי חוליות (T8).
4. מניפולציות זרוע הזנב באותו אופן לתפוס את גוף חוליות T10.
5. הנח את פלטפורמת ההתייצבות במכשיר ולהוריד את הקצה (בקוטר 0.75מ"מ) קרוב לכבל ככל האפשר מבלי לגעת בו.
6. הרם את הקצה שלושה סיבובים מלאים לפני ביצוע ההשפעה.
7. לבצע חבלה עם Impactor להגדיר כדי לספק כוח של 60 kdyn ב 100 מ"מ / sec.

6. תפרים וטיפול הודעה

1. תפר את החתך עם חוט תפירה נספג 4/0. מכסה את חוט השדרה החשוף באתר lamina הוסר; תפר את הרקמה בקצוות של החתך באמצעות מחט קטנה. לשים את שני תפרים באופן מיידי מעל ומתחת לאתר של חשיפת חוט השדרה.
2. סגור את העור באמצעות שניים או שלושה קליפים רפלקס בלי לצבוט את השרירים הבסיסיים.
3. מימה שלאחר ניתוח עכבר עם 2 מיליליטר של תמיסת מלח תת עורי הזריק בגב התחתון.
4. מניחים את העכבר בחזרה בכלוב מחומם מראש כדי להימנע מהיפותרמיה במהלך התאוששות כירורגית. כלובי מקום על כריות חימום.
5. לפקח על העכברים במהלך לאחר הפציעה השלב האקוטי על ידי הבדיקהשלפוחית ​​השתן גודל, תפר ומשקל החיה פעמיים ביום. יש ללחוץ בעדינות על שלפוחית ​​השתן (פעמיים ביום למשך 7 ימים), כדי למנוע הזיהומים (שתן יכול להיות מעונן, עקוב מדם, או שמכילים כל משקעים) של דרכי שתן.
6. פנק את העכברים פעם ביום עם הזרקת תמיסת מלח (2 מיליליטר ליומיים הזרקת sc לאחר ניתוח) ואנטיביוטיקה (0.2 מיליליטר gentamycin; הזרקת sc) במשך חמישה ימים לאחר פציעה.
7. פנק את העכברים לשיכוך כאבים שלאחר ניתוח עם עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם; פעמיים ביום) במשך 3 ימים לאחר פציעה.

7. זנב הזרקה לוריד של תאים

הערה: בשלב הבא בהליך להזרקת התאים לתוך וריד הזנב מודגם. תאים יכולים להיות גם מנוהלים עם השתלת intraspinal באמצעות מסגרת stereotaxic ^15-16, או לCisterna magna ^17. חשוב לקחת בחשבון כי סוגי תאים אחרים יכולים להיות מושתלים בשיטה זו, כגון תאי סטרומה mesenchymal(למשל, בתאי גזע mesenchymal מח עצם, תאי גזע שומן נגזר, תאים מי שפירים). יתר על כן, ניתן להזריק אפשרויות טיפול אחרות כגון חלקיקים דרך וריד הזנב לאחר הפגיעה בחוט השדרה.

1. השתמש 70% אתנול ו PBS לנקות את המחט לפני השימוש. ידית המחט והמזרק רק עם כפפות סטריליות.
2. Resuspend התאים במבחנה והעומס 75 μl של תאים לתוך מזרק 0.3 מיליליטר (29 מחט G ו0.33 מזרק סמ"ק).
3. ודא שאין בועות נמצאות בתוך ההשעיה התא. שמור את המזרק במצב אופקי כדי למנוע שקיעת תא.
4. מניחים את העכבר מתחת למנורת החום כדי להרחיב את ורידי הזנב.
5. תפוס את העכבר ומשוך בעדינות לתוך עוצר העכבר כדי להמחיש את וריד זנב לרוחב כקו כחול צר.
6. נקה את הזנב עם ספוגית אלכוהול. ברגע הווריד היא דמיינה, לתפוס את וריד הזנב בין האצבע לאגודל האמצע של יד שמאל.
7. להביא את המחט אל פני השטח בזווית 15 מעלות מהאופק ולוודא שפוע הוא למעלה.
8. הזרק 50 μl של תאים בשיעור של .33 μl / sec. לאחר ההזרקה, לעכב את הנסיגה של המחט על ידי 10 שניות. לחזור בו את המחט לאט ולשים לב לזרימה האפשרית של השעיה תא.
9. נקה את המזרק כמו בשלב 7.1 בין המון.

8. בדיקות התנהגותיות ותפקוד איבר הינד

1. מניחים את העכבר בשדה הפתוח.
2. אבחון תפקוד של תנועה והתאוששות גפיים אחורית לאחר חבלה במבחן השדה הפתוח על פי הסולם באסו עכבר (BMS) ^18.
   הערה: פונקצית נוירולוגיות יש להעריך מעת לעת, מיום 3 לאחר פציעה למשך 4 שבועות ^18.

9. זלוף

1. בתום תקופת הניסוי, להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של נתרן pentobarbital (65 מ"ג / קילוגרם). השתמש צובט הבוהן לevaluatדואר רמת ההרדמה ולהמשיך רק לאחר העכבר אינו מגיב לגירויים המזיקים.
2. לרסן את החיה במצב שכיבה על מטוס ניתוח.
3. לחתוך את integument ודופן בטן מתחת רק כלוב הצלעות. הפרד את הסרעפת מהכבד.
4. השתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת לחשוף את חלל פלאורלי.
5. חותך את הצדדים של כלוב הצלעות עד עצמות הבריח.
6. השתמש hemostats כדי לצבוט את סחוס xiphoid ולמקם את hemostat על הראש.
7. החזק את השליש התחתון של הלב על מטוס רוחבי עם המלקחיים. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי.
8. השתמש hemostat כדי לצבוט את הלב. זה מאבטח את המחט ומונע דליפה.
9. השתמש במספריים כדי לחתוך את העלייה הימנית.
10. לאפשר PBS לשאוב (18 מיליליטר / דקה) באמצעות בעלי החיים. לשמור על הלחץ הזה לאורך כל תקופת עירוי חיץ (3-4 דקות, מתאים לכ -70 מיליליטר PBS). המשך עד שהלב הוא נקי.
11. לעבור את השסתום כדי לאפשר מקבע (Paraformaldehyde 4% במים מזוקקים, 4% PFA) באמצעות המשאבה. לאפשר PFA 4% לשאוב באמצעות בעלי החיים לכ 8-10 דקות (300 מיליליטר). בהדרגה להגביר את הלחץ כדי להגיע למקסימום של 30 מיליליטר / דקה. כבד קשוח הוא האינדיקציה הטובה ביותר של זלוף מוצלח.

10. רקמות איסוף ועיבוד, היסטולוגיה וIimmunohistochemistry

1. לנתח מיתרי השדרה מT5 לL1. אז פוסט-לתקן את הרקמה ב 6 מיליליטר PFA 4% (O / N ב 4 ° C).
2. שים את אותה רקמה בפתרון עם סוכרוז 30% במשך 72 שעות על 4 מעלות צלזיוס כדי cryo להגן עליו ולמנוע היווצרות הגבישים במהלך הקפאה.
3. מהיר להקפיא את הכבל באמצעות קרח יבש ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
4. סעיף באמצעות cryostat עם 15 עובי מיקרומטר ולאסוף חלקים על גבי שקופיות זכוכית ולהמשיך לimmunocytochemistry.
5. יש לשטוף את חלקים עם 200 μl של PBS לכל sLIDE (3 פעמים; 5 דקות כל אחד, RT).
6. Permeabilize כל שקופית עם 200 μl של NGS 10% ושל 0.2% Triton X-100 ב PBS עבור שעה 1 ב RT.
7. יש לשטוף את חלקים עם 200 μl של PBS לכל שקופית (3 פעמים; 5 דקות כל אחד, RT).
8. לחסום אתרים שאינם ספציפיים עם 200 μl של חסימת פתרון לשקופיות (5% NGS; 0.1% Triton X-100 ב PBS) למשך 30 דקות (RT).
9. דגירה כל שקופית עם 200 μl של נוגדנים ראשוניים O / N ב 4 ° C (לדלל נוגדן ב 5% NGS; 0.1% Triton X-100 ב PBS).
10. לשטוף חלקים עם 200 μl של PBS לכל שקופית (3 פעמים; 5 דקות כל אחד; RT).
11. דגירה עם נוגדנים משני מתאימים לשעה 2 ב RT.
12. לשטוף חלקים עם 200 μl של PBS לכל שקופית (3 פעמים; 5 דקות כל אחד; RT).
13. גרעיני כתם עם 200 μl של 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי, 10 דקות ב RT).
14. הר על ידי שימוש במגיב FluorSave ולנתח על ידי מיקרוסקופ confocal.
    הערה: בקביעות שליטה, נוגדנים ראשוניים חייבים להיות מושמטים והוחלפו בריכוזים מקבילים של IgG שאינו קשור מאותו תת. חלבון 2 נוגדן ראשוני microtubule הקשורים היה בשימוש.

תוצאות

המספר הכולל של תאים מושתלים הוא 1 x 10 ⁶ תאים והיה מחולק לשלוש זריקות רצופות בוריד הזנב. אנחנו מנוהלים 3.3 x 10 ⁵ תאים ב -50 μl של פתרון חיץ פוספט (PBS). ההזרקה הראשונה בוצעה תוך 30 דקות לאחר פציעה, השניה 6 שעות מאוחר יותר ו-18 שעות האחרונות לאחר הפגיעה. הבחירה של מגבלת זמן...

Discussion

במאמר זה אנו תיארנו שיטה להשגת מודל לשחזור של פגיעה בחוט השדרה טראומטית באמצעות אופק Impactor אינסופית בכוח של 70 kdyne (חמור). שימוש בפרדיגמה גדולה יותר כוח (80 kdyne), אנחנו יכולים לגרום לפציעה חמורה יותר, כי למרבה הצער הוא קשור לתמותה גבוהה יותר עכברים. כדי להימנע מבעיה זו, אנחנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC