Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга

Резюме

Травма спинного мозга является травматический состояние, которое вызывает сильную заболеваемости и высокой смертности. В этой работе мы подробно контузии модель травмы спинного мозга у мышей с последующим трансплантации нервных стволовых клеток.

Аннотация

Травма спинного мозга является разрушительным клиническое состояние, характеризуется комплексом неврологических дисфункций. Животные модели травмы спинного мозга может быть использована как для изучения биологических ответов на травмы и тестирования потенциальных методов лечения. Ушиб или сжатия травм доставлены в хирургическое подвергаются спинного мозга являются наиболее широко используется модели патологии. В этом докладе экспериментальный ушиб осуществляется с помощью бесконечного горизонта (IH) ИМПАКТОРА устройство, которое позволяет создание воспроизводимой модели на животных травмы в результате определения конкретных параметров травмы. Трансплантация стволовых клеток обычно считается потенциально полезной стратегией для лечения этой изнурительной состоянии. Многочисленные исследования оценивали эффекты трансплантации различных стволовых клеток. Здесь показано, адаптированный способ травмы спинного мозга с последующим хвостовую вену инъекцией клеток у мышей CD1. Короче говоря, мы предоставляем процедуры: I) мечения клеток Wiго жизненного индикатора, II) предоперационная уход мышей, III) исполнение в contusive травмы спинного мозга, и IV) внутривенное введение посмертного нейронных предшественников. Эта модель контузии может быть использована, чтобы оценить эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток в регенеративной медицине подход.

Введение

Травмы спинного мозга (SCI) является наиболее распространенным повреждения, вызванные высокой энергии травмы, как автотранспортных средств аварий, падений, спортивных и насилие ^1. При тяжелой SCI, травмы сила разрушает или повреждает нервную ткань, вызывая внезапную потерю неврологической функции. Травматический SCI часто встречается в молодых взрослых в возрасте от 10 до 40 лет. Это сильно влияет на психическое и физическое состояние пациента и наносит огромный экономический эффект для общества ^2. Подход к лечению в острой фазе часто ограничивается высокой дозы кортикостероидов, хирургическая стабилизация и декомпрессии, возможно, ослабить дальнейшее повреждение ^3-4, но роль этих методов по восстановлению опорно-двигательного аппарата после ТСМ-прежнему спорным. В дополнение к острой потере тканей, травматического повреждения и активации вторичных механизмов дегенерации причиной демиелинизации и гибели нескольких типов клеток ^5-6. Степень восстановления функции можно,десять коррелирует в пределах пощадил белого вещества в месте повреждения ^7.

Животные модели ТСМ могут быть использованы как для исследования биологических реакций ткани на травму и тестирования потенциальных методов лечения. Кроме того, полезную модель животного в патологии человека имеет не только воспроизводить некоторые аспекты этого состояния, но также должны предложить преимущества по сравнению с непосредственным клиническим наблюдением и экспериментом. Наиболее широко используемые модели травмы спинного мозга связаны контузии или сжатия травм доставлен в хирургическое подвергаются спинного мозга ^8. Развитие контролируемой травмы веса падение ушиба представляют собой важную веху в истории исследований SCI. Университет штата Огайо спинного мозга исследовательский центр проводит технологическую проблему устройства, которые могут быть использованы, чтобы вызвать определенную компрессию спинного мозга с параметрами воздействия контролируемых компьютером ^9. Это был первоначально разработан для использования Wiго крыс; позже он был изменен, чтобы применить к мышей ^10. Преимущества такого подхода является то, что биомеханики травмы могут быть изучены более подробно и параметры травмы могут быть определены в более полном образом, чтобы получить воспроизводимый экспериментальную модель, поэтому обеспечивает более точную оценку воздействия проверенные методы лечения на процесс функционального восстановления.

Многие исследования оценили трансплантации эффекты различных стволовых клеток в моделях ТСМ ^11. Мы недавно выделенный взрослых нервные стволовые клетки из подменю вентрикулярной зоне (SVZ) через несколько часов после смерти донора мыши ^12-13. Эта процедура обеспечивает население нервных стволовых клеток, называется вскрытий нейронных предшественников (PM-НПС), которые, кажется, чтобы быть выгодным в регенеративной подхода лекарственный препарат для лечения ТСМ. В этой статье мы покажем: я) протокол для маркировки клеток с жизненной примеси PKH26, II) Surgческих процедура для выполнения на черепно-SCI, и III) для внутривенного введения (IV) введение меченых клеток. Кроме того, в этой работе показано, что трансплантированные клетки мигрируют в спинного мозга поврежденных участках и дифференцировать в основном в ассоциированный с микротрубочками белка (MAP) 2-позитивных клеток. Кроме того, дифференциация сопровождается продвижения устойчивого восстановления функции задних конечностей.

протокол

Примечание: Все процедуры были одобрены комитетом по рассмотрению университета Милане и встретился с итальянским рекомендаций для лабораторных животных в соответствии с Европейской директивой Сообщества от ноября 1986 (86/609 / EEC).

1. Подготовка клеток для трансплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нервные стволовые клетки между 5-м и 9-м проходе в культуре в течение этих экспериментов; проверить культуры для пролиферации и дифференцировки способности перед помечены для трансплантации. Определить степень дифференциации иммуноцитохимически ^12.

1. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 х 10 ⁶ клеток / 150 мкл (трансплантации 1 × 10 ⁶ клеток на мышь). Подготовка по меньшей мере, 1,2 × 10 ⁶ клеток на мышь, так как избыток клеток требуется для целей шприцы нагрузки.
2. Вымойте клетки 3 раза с использованием среды нервные стволовые клетки ¹³ в 10 мл коническую пробирку. В каждомстадию промывки, осадок клеток путем центрифугирования (500 мкг в течение 5 мин, RT).
3. Граф клеток до окончательного отжима.
4. Центрифуга клетки (500 мкг в течение 5 мин), а затем аспирата супернатант, стараясь не удалить все клетки, но оставляя не более 25 мкл супернатанта.
5. Подготовка 2x клеточной суспензии путем добавления 1 мл разбавител C к осадку клеток и ресуспендируют с осторожно пипеткой.
6. Непосредственно перед окрашиванием, подготовить 2x раствора красителя (4 х 10 ^{- 6} М) в разбавителе С добавлением 4 мкл раствора этанола красителя PKH26 1 мл разбавител С в трубке и хорошо перемешать, чтобы разойтись.
7. Быстро добавить 1 мл 2 раза клеточной суспензии к 1 мл раствора красителя 2x и сразу же смешать образец с помощью пипетки (конечную плотность клеток будет 1,2 х 10 ⁷ клеток / мл и 2 х 10 ^{- 6} М PKH26).
8. Выдержите клеточной суспензии / краски в течение 1-5 мин.
9. Остановите окрашивание путем добавления равного объема (2мл) 1% раствора BSA в HBSS и инкубировали в течение 1 мин.
10. Центрифуга клетки (500 х г в течение 10 мин) и тщательно удалить супернатант.
11. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл HBSS и центрифуге (500 мкг в течение 5 мин).
12. Промыть осадок клеток еще 2 раза с 10 мл полной среды, чтобы обеспечить удаление несвязанного красителя.
13. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл полной среды для оценки восстановления клеток, выживаемость клеток и интенсивности флуоресценции. Если клетки необходимы для трансплантации, мыть и ресуспендируют их в стерильном физиологическом растворе в концентрации 3,3 × 10 ⁵ клеток / 50 мкл.

2. Подготовка к операции

1. Очистки и стерилизации хирургия Оборудование.
2. Подготовьте область хирургии, вытирая с асептическим агентом. Настройка устройства IH ударника.
3. Подготовка анестезиологического оборудования: активный газ Scavenger с VetScav Фильтр устройством для взвешивания, непрерывный поток индукции камеры, кислорода Generator, низкого расхода O ₂ Meter для мышей. Очистите индукции камеры и маска, используемая во время операции.
4. Обезболить животных с 2,5% (V / V) изофлураном в кислороде (1 л / мин), и ждать 5 минут после подачи индукции для наркотиков вступили в силу. Проверьте, если усы дергались, или если есть медленно задних конечностей денег в ответ на ущемление подушечку. Во время операции, снизить изофлуран концентрации до 2,0% (объем / объем) изофлуран в кислороде (1 л / мин).

3. Подготовка мышей для хирургии и трансплантологии

1. Держите взрослый мужчина CD1 мышей (25-30 г) в течение по крайней мере 3 дней до экспериментов в стандартных условиях (22 ± 2 ° С, 65% влажности, а искусственный свет между 08:00 до 8:00 вечера).
   ПРИМЕЧАНИЕ: вся процедура от хирургического подготовки к наложения швов займет около 40 мин.
   1. Чтобы определить животное, отметьте хвост с помощью водонепроницаемого цветными чернилами.
2. Используйте электроIC клипер сократить спинной волосы мыши от шеи, около на уровне Т2, в поясничной области.
3. Стерилизовать подготовленный участок с иодидом раствора и этанола (70% в стерильной воде).
4. Лечения животного с суб кожной (SC) инъекции 200 мкл гентамицина (1 мг / мл в стерильном солевом растворе).
5. Применение глазной смазку обоих глаз животных, чтобы предотвратить высыхание и вводят бупренорфин (подкожно, 0,03 мг / кг), чтобы облегчить боль.

4. Ламинэктомия

1. Наведите на слайд теплее избежать проблемы гипотермии во время операции. Расположите животное с спинной стороной вверх.
2. Сделайте вертикальный разрез скальпелем над интересующей нас области, из Т7 Т12.
3. Держите кожу и поверхностные жировой ткани с помощью стандартных щипцов (обычно находится в пространстве между ^5-й и ^6-й грудной процессов спинной).
4. Граф процесс под сосудом, как T6затем перейти к Т7.
5. Поместите немного подшипник под брюшной стороне мыши, чтобы увеличить искривление позвоночника. Остановите спинной мозг, блокируя его с помощью пинцета Грефе.
6. Разрежьте паравертебральных мышц на двусторонней основе с T7 и T10 позвонка уровне, не используя скальпель, пока дорсальной поверхности пластинки контактов наконечников скальпель.
7. Используйте скальпель, чтобы поставить галочку в стык с Т7 до Т10. Остановка в пространстве между Т8 и Т9 колючих выступов. Вырезать ткани между T8-T9 и T9-T10 с микро ножницами.
   1. Используйте костными кусачками, чтобы удалить процесс T9. Expose стык, тщательно очищая от мышечного слоя с микро ножницами. Продолжайте, пока кости не подвергается.
8. Используйте пинцет, чтобы удалить мышцы от пластинки и открыть небольшое пространство между позвонками. Аккуратно вставьте микро ножницы под кости, разрезать пластинку с обеих сторон и снимите эту деталь щипцами.
9. Снимите пластинку с Forceps подвергать кабель. Будьте уверены, чтобы не оставить любые свободные или зазубренные костные фрагменты позади; удалить их с костными кусачками.
10. Используйте маленькие щипцы Совет, чтобы удалить надкостницы, а также любые фрагменты кости или мышцы, что может быть рядом с разрезом.
11. Снимите верхнюю половину процесса спинной T9 и перейти к протоколу устройства IH ударника.

5. IH Impactor протокол устройства (контузии)

1. Место мыши в середине стабилизации платформы устройства IH ударника.
2. Блок животное с двумя зубами щипцов, связанных с платформой стабилизация двух совместных позиционирования оружия (левую руку для грудного позвонка, правая рука для шейного позвонка).
3. Используйте ростральную руку, чтобы схватить боковой край Ростральные тела позвонка (T8).
4. Манипулирование хвостовой руку таким же образом понять T10 тела позвонка.
5. Поместите платформу стабилизации в устройстве и снизить наконечник (диаметр 0,75мм) как можно ближе к шнуру, как можно, не касаясь его.
6. Поднимите кончик три полных оборота до начала воздействия.
7. Выполнение контузию с ударного набора для доставки силу 60 kdyn при 100 мм / сек.

6. Швы и пост-уход

1. Шовный разрез с 4/0 рассасывающийся шовный нити. Накройте подвергается спинного мозга на месте удаленной пластинки; шов ткань на концах разреза с помощью тонкой иглы. Поместите два шва непосредственно над и под воздействием месте спинного мозга.
2. Закройте кожу с помощью двух или трех Reflex клипы без щипать от основные мышцы.
3. Гидратации мыши после операции с 2 мл физиологического раствора подкожно в нижней части спины.
4. Наведите назад в предварительно нагретой клетке, чтобы избежать переохлаждения во время хирургического восстановления. Место клетки на грелки.
5. Монитор мышей во время острой фазы после травмы, проверяяразмер пузыря, шовный материал и вес животных два раза в день. Слегка сожмите пузырь (дважды в день в течение 7 дней), чтобы избежать инфекции (мочу может быть облачно, кровавый или содержащие какие-либо осадки) мочевыводящих путей в.
6. Лечить мышей один раз в день с инъекции соляного раствора (2 мл в течение двух дней после операции подкожной инъекции) и антибиотика (гентамицина 0,2 мл; подкожных инъекций) в течение пяти дней после травмы.
7. Treat мышей для послеоперационной анальгезии с бупренорфина (0,1 мг / кг; два раза в день) в течение 3 дней после травмы.

7. хвостовую вену инъекции клеток

Примечание: В следующем шаге процедура инъекции клеток в хвостовую вену показано. Клетки могут также вводиться с интраспинальное трансплантата с использованием стереотаксической рамы ^15-16, или в цистерна ^17. Важно учесть, что другие типы клеток могут быть пересажены с помощью этого метода, такие как мезенхимальных стромальных клеток(например, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани, стволовые клетки, клетки амниотической жидкости). Кроме того, другие варианты лечения, такие как наночастицы могут быть введены через хвостовую вену после травмы спинного мозга.

1. Использование 70% этанола и PBS для очистки иглу перед использованием. Ручка иглу и шприц только с стерильные перчатки.
2. Ресуспендируют клеток в пробирке и нагрузки 75 мкл клеток в 0,3 мл шприца (29 г иглы и шприца 0,33 см).
3. Убедитесь, что нет пузырей присутствуют в клеточной суспензии. Держите шприц в горизонтальном положении, чтобы избежать клеток осадка.
4. Наведите под инфракрасной лампой для расширения вены хвоста.
5. Возьмите мышь и осторожно потяните его в фиксатор мыши, чтобы визуализировать боковой хвостовой вены в виде узкого синей линии.
6. Очистите хвост с тампоном, смоченным спиртом. После того, как вена визуализируется, схватить за хвост вену между средним и указательным пальцами левой руки.
7. Принесите иглу к поверхности на 15 ° угол от горизонта и убедитесь, коническая вверх.
8. Вводят 50 мкл клеток в размере 0,33 мкл / сек. После инъекции, задержать отвод иглы на 10 сек. Уберите иглу медленно и обратить внимание на возможное оттока клеточной суспензии.
9. Очистите шприц, как в шаге 7,1 между нагрузками.

8. Поведенческие тесты и задних конечностей Функция

1. Наведите в открытом поле.
2. Оценка функции опорно-двигательного и задние восстановление конечностей после контузии с тесте открытого поля по шкале мыши бассо (BMS) ^18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При неврологическом функция должна оцениваться периодически, от 3 ​​день после травмы в течение 4 недель ^18.

9. перфузии

1. В конце экспериментального периода, обезболивания животных путем внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (65 мг / кг). Используйте ног щепотки на evaluatе уровень анестезии и перейти только после мышь не отвечает на вредных раздражителей.
2. Задержите животное в положении лежа на спине на операции плоскости.
3. Разрезать покровов и брюшной стенки прямо под грудной клеткой. Отделите мембрану из печени.
4. Используйте ножницы, чтобы вырезать диафрагму выставить в плевральную полость.
5. не Отрежьте стороны грудной клетки до ключицами.
6. Используйте кровоостанавливающих, чтобы зажать мечевидного хряща и поместите кровоостанавливающего над головой.
7. Удерживая нижнюю треть сердце на поперечной плоскости при помощи щипцов. Вставьте иглу в левый желудочек.
8. Используйте кровоостанавливающего, чтобы зажать сердце. Это обеспечивает иглы и предотвращает утечку.
9. Используйте ножницы, чтобы вырезать в правое предсердие.
10. Дайте PBS, чтобы насос (18 мл / мин) через животного. Поддержание это давление в течение всего периода инфузии буфера (3-4 мин; что соответствует примерно 70 мл PBS). Продолжайте, пока сердце не станет чистым.
11. Переключатель кран, чтобы позволить фиксатора (4% параформальдегида в дистиллированной воде, 4% PFA) через насос. Разрешить 4% PFA прокачивать животного в течение примерно 8-10 мин (300 мл). Постепенно увеличивайте давление, чтобы достичь максимума 30 мл / мин. Закаленные печени лучшим свидетельством успешной перфузии.

10. Ткань Сбор и обработка, гистологии и Iimmunohistochemistry

1. Проанализируйте спинного мозга T5 в L1. Тогда после фиксации ткани в 6 мл 4% PFA (O / N на 4 ° C).
2. Поместить той же ткани в растворе с 30% сахарозы в течение 72 ч при 4 ° С для того, чтобы защитить его крио и предотвратить образование кристаллов при замораживании.
3. Краткое замораживать шнур с использованием сухого льда и хранить его при температуре -80 ° С.
4. Раздел помощью криостата с 15 толщиной мкм и собирать разделы на стеклах и продолжаться в течение иммуноцитохимии.
5. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого хLiDE (3 раза; 5 мин каждый, RT).
6. Проницаемыми каждый слайд с 200 мкл 10% NGS и 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Промыть участки с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый, RT).
8. Блок неспецифические сайты с 200 мкл блокирующего раствора для слайд (5% NGS 0,1% Triton X-100 в PBS) в течение 30 мин (RT).
9. Инкубируют каждый слайд с 200 мкл первичных антител O / N при 4 ° С (разбавленной антитела в 5% NGS; 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР).
10. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый; РТ).
11. Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
12. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый; РТ).
13. Пятно ядра с 200 мкл 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 мкг / мл конечной концентрации 10 мин при комнатной температуре).
14. Установите с помощью FluorSave Реагент и анализировать с помощью конфокальной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вконтроль определения, первичные антитела должны быть опущены и заменены эквивалентными концентраций несвязанного IgG одного и того же подкласса. Был использован, ассоциированный с микротрубочками белка 2 первичное антитело.

Результаты

Общее количество трансплантированных клеток 1 × 10 ⁶ клеток и был разделен на три последовательных инъекций в хвостовую вену. Мы вводили 3,3 × 10 ⁵ клеток в 50 мкл фосфатного буферного раствора (PBS). Первую инъекцию проводили в течение 30 мин после травмы, второй 6 ч позже, и наконец 18 ...

Обсуждение

В этой статье мы описали метод получения воспроизводимых модель травматического повреждения спинного мозга с использованием бесконечного горизонта Impactor в силу 70 Кдыне (тяжелой). Использование большего силы парадигму (80 Kdyně), мы можем вызвать более серьезные травмы, которые, к сожалени...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC