Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Resumo

A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.

Resumo

A lesão medular é uma condição clínica devastadora, caracterizada por um complexo de disfunções neurológicas. Os modelos animais de lesão da medula espinal pode ser utilizado tanto para investigar as respostas biológicas a lesões e para testar terapias potenciais. Contusão ou compressão lesão entregue à medula espinal exposta cirurgicamente são os modelos mais amplamente utilizados de patologia. Neste relatório, a contusão experimental é realizada utilizando o dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite a criação de um modelo animal lesão reprodutível através da definição de parâmetros de lesão específica. O transplante de células-tronco é comumente considerado uma estratégia potencialmente útil para a cura desta doença debilitante. Numerosos estudos têm avaliado os efeitos do transplante de uma variedade de células estaminais. Aqui demonstramos um método adaptado para lesão da medula espinal, seguido por injecção na veia da cauda de células em ratos CD1. Em suma, nós fornecemos procedimentos para: i) marcação celular with um traçador vital, ii) o atendimento pré-operatório de ratos, iii) execução de uma lesão medular contundente, e iv) a administração intravenosa de pós mortem precursores neurais. Este modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia e segurança de transplante de células estaminais em uma abordagem de medicina regenerativa.

Introdução

A lesão medular (LM) é a lesão mais comum causada por trauma de alta energia, como veículos automóveis acidentes, quedas, esportes e violência ^1. Em grave SCI, a força lesão destrói ou danifica o tecido neural, causando perda súbita da função neurológica. Traumatic SCI ocorre frequentemente em adultos jovens entre 10 e 40 anos de idade. Ela afeta grandemente condição mental e física do paciente e causa enorme impacto econômico para a sociedade ^2. A abordagem de tratamento na fase aguda é geralmente limitada a uma alta dose de corticosteróide, a estabilização cirúrgica e descompressão para possivelmente atenuar danos maiores ^3-4, mas os papéis desses métodos na recuperação locomotora após SCI ainda são controversos. Além da perda de tecido aguda, lesão traumática e a activação de mecanismos secundários de degeneração causa desmielinização e morte de vários tipos de células ^5-6. O grau de recuperação da função pode dedez ser correlacionado com a extensão da matéria branca poupado no local da lesão ^7.

Os modelos animais de SCI pode ser usado tanto para investigar as respostas biológicas do tecido a lesão e para testar terapias potenciais. Além disso, um modelo animal útil de uma patologia humana, não só tem que reproduzem alguns aspectos dessa condição, mas deve também oferecer vantagens sobre observação clínica directa e experimento. Os modelos mais amplamente utilizados de lesão da medula espinal ou contusão envolvem compressão lesão entregue para a medula espinal exposta cirurgicamente ^8. O desenvolvimento de uma contusão peso-drop controlados representam um marco importante na história da pesquisa SCI. O centro de pesquisa medula espinhal Ohio State University tem prosseguido o desafio tecnológico de um dispositivo que pode ser usado para induzir uma compressão particular da medula espinal com parâmetros de impacto controlado por um computador ^9. Esta foi originalmente projetado para uso with ratos; mais tarde foi modificado para aplicar em direção camundongos ^10. As vantagens deste tipo de abordagem é que a biomecânica da lesão pode ser estudado com mais profundidade e os parâmetros de lesão pode ser definida de uma maneira mais completa, a fim de obter um modelo experimental reproduzível, portanto, permitindo uma avaliação mais precisa dos efeitos de tratamentos testados sobre o processo de recuperação funcional.

Muitos estudos avaliaram os efeitos de transplante de uma variedade de células-tronco em modelos SCI ^11. Temos recentemente isolado adultos neural células-tronco a partir da Sub-Ventricular Zone (SVZ) várias horas após a morte do doador do mouse ^12-13. Este procedimento proporciona uma população de células-tronco neurais, chamado post mortem precursores neurais (PM-NPCs), que parecem ser vantajoso em uma abordagem da medicina regenerativa para curar SCI. Neste artigo vamos demonstrar: i) o protocolo de marcação celular com o PKH26 tracer vital, ii) o surgical procedimento para executar em SCI traumático, e iii) a administração intravenosa (iv) administração de células marcadas. Além disso, neste trabalho demonstram que as células transplantadas migrar para locais de lesão da medula espinhal e diferenciar principalmente em proteína associada microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Além disso, a diferenciação é acompanhada pela promoção de uma recuperação estável da função dos membros posteriores.

Protocolo

Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão da Universidade de Milão e se encontrou com as Diretrizes italianos para Animais de Laboratório em conformidade com a Directiva Europeia Comunidades datado de Novembro de 1986 (86/609 / CEE).

1. Preparação de células para transplantes

NOTA: Use as células-tronco neurais entre os dias 5 e 9 passagem em cultura para estas experiências; testar as culturas para a proliferação e diferenciação capacidade antes de serem rotulados para transplante. Determinar a extensão de diferenciação de ¹² por imunocitoquímica.

1. Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / 150 uL (transplante 1 x 10 ⁶ culas por ratinho). Preparar pelo menos 1,2 x 10 ⁶ culas por rato por causa de um excesso de células é necessária para fins de carregamento seringa.
2. Lave as células 3 vezes com o meio de células-tronco neurais ¹³ em um frasco de 10 ml cônico. Em cadapasso de lavagem, as células precipitadas por centrifugação (500 xg durante 5 min, RT).
3. Contar as células antes da rodada final.
4. Centrifuga-se as células (500 xg durante 5 min), e, em seguida, aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não remover todas as células, mas não deixando mais do que 25 ul de sobrenadante.
5. Prepara-se uma suspensão de células de 2 x por adição de 1 ml de diluente de C para a pelete de células e ressuspender com pipetagem suave.
6. Imediatamente antes da coloração, preparar uma solução 2x da tintura (4 x ^10-6 M) em Diluente C por adição de 4 ul de solução de corante etanol PKH26 para 1 ml de diluente de C em um tubo e misturar para dispersar bem.
7. Rapidamente adicionar os 1 ml de suspensão de células para 2 x 1 ml de 2x solução de corante e misturar imediatamente a amostra, pipetando (densidade celular final será 1,2 x 10 ⁷ células / ml e 2 x ^10-6 M PKH26).
8. Incubar a suspensão de células / corante durante 1-5 minutos.
9. Pare a coloração por adição de um volume igual (2ml) de solução de BSA a 1% em HBSS e incubar durante 1 min.
10. Células de centrifugação (500 xg por 10 min) e cuidadosamente remover o sobrenadante.
11. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de HBSS e centrifugação (500 xg durante 5 min).
12. Lava-se a pelete de células mais duas vezes com 10 ml de meio completo para assegurar a remoção de corante não ligado.
13. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio completo para a avaliação da recuperação das células, viabilidade celular e a intensidade de fluorescência. Se forem necessárias para o transplante de células, lavar e ressuspender-los numa solução fisiológica estéril a uma concentração de 3,3 x 10 ⁵ células / 50 ul.

2. Preparação para Cirurgia

1. Equipamentos de cirurgia limpar e esterilizar.
2. Prepare a área de cirurgia, limpando com um agente asséptico. Configure o dispositivo IH do pêndulo.
3. Prepare o aparelho de anestesia: o Scavenger gás ativo com Filtro VetScav Pesando dispositivo, fluxo contínuo de indução Câmara, Gene Oxygenrator, Low Flow O ₂ Medidor por Mice. Limpe a câmara de indução e a máscara usada durante a cirurgia.
4. Anestesiar os animais com 2,5% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min), e esperar 5 min após a indução de fluxo para o medicamento tenha efeito. Verifique se os bigodes estão se contraindo ou se houver a retirada do membro posterior lento em resposta a beliscar a pata. Durante a cirurgia, reduzir a concentração de isoflurano a 2,0% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min).

3. Preparação de Ratos de Cirurgia e Transplante

1. Mantenha o CD1 camundongos adultos do sexo masculino (25-30 g) por pelo menos 3 dias antes dos experimentos em condições normais (22 ± 2 ° C, 65% de umidade e luz artificial entre 08h00 - 20:00).
   NOTA: Todo o processo de preparo cirúrgico para sutura levará cerca de 40 min.
   1. Para identificar o animal, marcar a cauda por meio de tinta colorida resistente à água.
2. Use um electric clipper para cortar o cabelo dorsal do rato a partir do pescoço, sobre a nível T2, a região lombar.
3. Esterilizar a área preparada com uma solução de iodeto e de etanol (70% em água estéril).
4. Tratar o animal com uma sub cutânea (sc) de injecção de 200 uL de gentamicina (1 mg / ml em solução salina estéril).
5. Aplicar lubrificante oftalmológico em ambos os olhos dos animais para prevenir a dessecação e injectar buprenorfina (por via subcutânea, 0,03 mg / kg) para aliviar a dor.

4. Laminectomy

1. Posicione o mouse sobre um aquecedor de slides para evitar o problema de hipotermia durante a cirurgia. Posicione o animal com o dorsal para cima.
2. Adicione uma incisão vertical com um bisturi ao longo da região de interesse, a partir de T7 a T12.
3. Mantenha a pele ea almofada de gordura superficial usando fórceps convencionais (normalmente encontrada no espaço entre a 5 ^e 6 de processos torácica dorsal).
4. Contar o processo sob o vaso como T6em seguida, passar a T7.
5. Coloque um pouco rolamento sob o lado ventral do ratinho para aumentar a curvatura da coluna vertebral. Imobilizar a medula espinhal, bloqueando-o com a pinça Graefe.
6. Corte os músculos paravertebrais bilateral de T7 e T10 nível vertebral usando o bisturi até que a superfície dorsal dos contactos a ponta da lâmina de bisturi.
7. Use o bisturi para assinalar fora da junção de T7 até T10. Pare no espaço entre T8 e T9 saliências espinhosas. Cortar os tecidos entre T8-T9 e T9-T10 com as micro tesoura.
   1. Use a Rongeur para remover o processo T9. Exponha a junção com cuidado raspar a camada muscular com os micro tesoura. Continue até que o osso é exposto.
8. Utilizar as pinças para remover músculos da lâmina e abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Insira com cuidado as micro tesoura sob o osso, corte a lâmina em ambos os lados e remover esta parte com uma pinça.
9. Retire a lâmina com a forceps para expor o cabo. Cuidado para não deixar quaisquer fragmentos de ossos gratuitos ou irregulares para trás; removê-los com o Rongeur.
10. Use as pequenas pinças ponta para remover o periósteo bem como quaisquer fragmentos de ossos ou músculos que pode estar próximo da incisão.
11. Remova a metade superior do processo dorsal T9 e prosseguir com o protocolo dispositivo IH do pêndulo.

5. IH Impactor Dispositivo Protocol (contusão)

1. Colocar o rato no meio da plataforma do dispositivo de estabilização IH Impactor.
2. Bloqueie o animal com as duas pinças de dentes relacionados com a plataforma de estabilização por dois braços de posicionamento articular (braço esquerdo para a vértebra torácica, o braço direito para vértebra cervical).
3. Use o braço rostral para segurar a borda lateral do corpo vertebral rostral (T8).
4. Manipular o braço caudal da mesma maneira de entender o corpo vertebral T10.
5. Coloque a plataforma de estabilização no dispositivo e diminuir a ponta (diâmetro 0,75mm) mais próximo possível do cabo quanto possível, sem tocá-lo.
6. Levante a ponta três voltas completas antes de iniciar o impacto.
7. Realize a contusão com o pêndulo definido para entregar uma força de 60 kdyn a 100 mm / s.

6. suturas e pós-atendimento

1. Suturar a incisão com um 4/0 absorvível fio de sutura. Cobrir a medula espinal exposta no local da lâmina removida; suturar o tecido nas extremidades do corte por meio de uma pequena agulha. Colocar os dois pontos imediatamente acima e abaixo do local de exposição da medula espinal.
2. Feche a pele usando dois ou três clipes Reflex sem beliscar fora os músculos subjacentes.
3. Hidrate o mouse pós-cirurgia com 2 ml de solução salina subcutânea na região lombar.
4. Posicione o mouse de volta em uma gaiola pré-aquecido para evitar hipotermia durante a recuperação cirúrgica. Coloque as gaiolas em almofadas de aquecimento.
5. Monitorar os ratos durante a fase aguda pós-lesão, verificando atamanho da bexiga, o fio de sutura e o peso do animal, duas vezes por dia. Aperte delicadamente bexiga (duas vezes por dia durante 7 dias) para evitar infecções (urina poderia ser nublado, com sangue ou que contenham quaisquer precipitados) do trato urinário.
6. Tratar os ratos uma vez por dia com uma injecção de solução salina (2 mL durante dois dias pós-cirurgia de injecção sc) e antibiótico gentamicina (0,2 mL; injecção sc) durante cinco dias após a lesão.
7. Tratar os ratos para analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,1 mg / kg, duas vezes por dia) durante 3 dias após a lesão.

7. Cauda Vein injeção de células

NOTA: Para o passo seguinte do processo para injectar as células na veia da cauda é demonstrada. As células podem ser também administrada com um transplante de intraspinal usando um quadro estereotáxico ^15-16, ou na cisterna magna ^17. É importante considerar que outros tipos de células podem ser transplantadas com este método, tais como as células estromais mesenquimatosas(por exemplo, da medula óssea, células-tronco mesenquimais derivadas de células-tronco adiposas, células do líquido amniótico). Além disso, outras opções de tratamento, tais como as nanopartículas podem ser injectados através da veia da cauda após a lesão da medula espinal.

1. Use etanol a 70% e PBS para limpar a agulha antes da utilização. Lidar com a agulha e seringa apenas com luvas estéreis.
2. Ressuspender as células em tubos de ensaio e de carga de 75 ul de células dentro de uma seringa de 0,3 ml (29 L agulha e seringa 0,33 cc).
3. Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da suspensão celular. Manter a seringa na posição horizontal para evitar a sedimentação de células.
4. Posicione o mouse sob a lâmpada de calor para dilatar as veias da cauda.
5. Pegue o mouse e puxe-o na restrainer mouse para visualizar a veia lateral da cauda como uma linha azul estreita.
6. Limpe a cauda com um algodão embebido em álcool. Uma vez que a veia é visualizado, pegue na veia da cauda entre o polegar eo dedo médio da mão esquerda.
7. Traga a agulha para a superfície em um ângulo de 15 ° a partir do horizonte e certifique-se o bisel é para cima.
8. Injectar 50 jil de células, a uma taxa de 0,33 l / seg. Após a injecção, atrasar a retracção da agulha por 10 seg. Retirar a agulha devagar e preste atenção para a possível efluxo de suspensão de células.
9. Limpe a seringa como no passo 7.1 entre as cargas.

8. Testes comportamentais e Função Hind Limb

1. Posicione o mouse no campo aberto.
2. Avaliar a função locomotora e recuperação dos membros posteriores após contusão com o teste de campo aberto de acordo com a escala do mouse Basso (BMS) ^18.
   NOTA: A função neurológica deve ser avaliada periodicamente, a partir do dia 3 após a lesão durante 4 semanas ^18.

9. Perfusão

1. No final do período experimental, anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (65 mg / kg). Use pitadas toe para Avaliado come o nível de anestesia e prosseguir apenas depois do mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.
2. Contenha o animal em decúbito dorsal em um avião cirurgia.
3. Corte através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Separa-se a membrana a partir do fígado.
4. Use a tesoura para cortar o diafragma para expor a cavidade pleural.
5. Cortar os lados da caixa torácica até que os ossos da clavícula.
6. Use os hemostats para prender a cartilagem xifóide e colocar a pinça hemostática sobre a cabeça.
7. Segure o terço inferior do coração em um plano transversal com a pinça. Insira a agulha para o ventrículo esquerdo.
8. Utilize uma pinça hemostática para prender o coração. Isto assegura que a agulha e impede a fuga.
9. Use a tesoura para cortar o átrio direito.
10. Permitir que o PBS para bombear (18 ml / min) através do animal. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão (3-4 min; correspondente a cerca de 70 ml de PBS). Continue até que o coração é limpo.
11. Alternar a torneira para permitir que o fixador (4% de paraformaldeído em água destilada, PFA a 4%) através da bomba. Permitir que o PFA a 4% para bombear através do animal durante cerca de 8-10 min (300 ml). Aumentar gradualmente a pressão até atingir um máximo de 30 ml / min. Um fígado endurecido é a melhor indicação de uma perfusão de sucesso.

10. Tissue recolha e processamento, Histologia e Iimmunohistochemistry

1. Dissecar medulas espinhais de T5 a L1. Em seguida, pós-fixar o tecido em 6 ml em 4% PFA (O / N a 4 ° C).
2. Coloque o mesmo tecido em uma solução com 30% de sacarose durante 72 horas a 4 ° C, a fim de protegê-lo e crio para impedir a formação de cristais durante o congelamento.
3. Resfriamento rápido o cabo usando gelo seco e armazená-lo a -80 ° C.
4. Secção por meio de um criostato com 15 mm de espessura e recolher secções sobre lâminas de vidro e continuar para imunocitoquímica.
5. Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 minutos cada, temperatura ambiente).
6. Permeabilizar cada lâmina com 200 ul de 10% NGS e 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA.
7. Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 min cada, RT).
8. Bloquear os sítios não específicos com 200 ul de solução para a corrediça de bloqueio (5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min (RT).
9. Incubar cada lâmina com 200 ul de anticorpos primários O / N a 4 ° C (anticorpo diluído em 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS).
10. Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT).
11. Incubar com anticorpos secundários apropriados durante 2 horas à TA.
12. Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT).
13. Stain núcleos com 200 ul de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentração final, 10 minutos à temperatura ambiente).
14. Montar usando o Reagente FluorSave e analisar por microscopia confocal.
    NOTA: Emdeterminações de controlo, anticorpos primários deve ser omitida e substituída com concentrações equivalentes de IgG não relacionados da mesma subclasse. Foi utilizada associada a microtúbulos Protein 2 anticorpo primário.

Resultados

O número total de células transplantadas é 1 x 10 ⁶ células e foi dividido em três injecções consecutivas na veia da cauda. Nós administrado 3,3 x 10 ⁵ células em 50 ul de solução tampão de fosfato (PBS). A primeira injecção foi realizada no prazo de 30 minutos após a lesão, o segundo 6 horas mais tarde e as últimas 18 horas após a lesão. A escolha de um limite de tempo de 18 horas após a administração de SCI para PM-NPCs foi determinada pela permeabilidade óptima da barreira...

Discussão

Neste artigo é descrito um método para obter um modelo reprodutível de lesão medular traumática usando um Infinito Horizon Impactor com uma força de 70 Kdyne (grave). Usando um paradigma força maior (80 Kdyne), que pode causar uma lesão mais grave que, infelizmente, está associado à mortalidade camundongos mais elevados. Para evitar esse problema, é comumente escolher um paradigma força moderada (70 Kdyne) que está associado a uma lesão repetíveis com uma recuperação gradual da função e menor mortalid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device	Precision Systems and Instrumentation, LLC	Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Scalpel, size 10	Lance Paragon	26920
Small Graefe Forceps	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro scissors	2Biological Instruments	15000-00
Absorbable sutures (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Reflex 7 wound clip applicator	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex wound clips	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave Reagent	Calbiochem	345789
Neural stem cells medium			DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutamine	Euroclone	ECB3000D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodium-selenite	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrin	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulin	Sigma-Aldrich	I1882
Heparin sodium-salt	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorphine	Schering Plough SpA	TEMGESIC
eye gel	Bausch & Lomb	LIPOSIC