测量氧化应激性<em&gt;秀丽隐杆线虫</em&gt;在96孔微量滴定板

摘要

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

摘要

氧化应激，这是生产和活性氧解毒之间的不平衡的结果，是一个主要贡献者慢性人类疾病，包括心血管和神经变性疾病，糖尿病，老化和癌症。因此，研究氧化应激不仅在细胞系统中，但也使用整个生物体是重要的。C.线虫是一个有吸引力的模式生物，研究了氧化应激信号转导通路，这是高度进化上保守的基因。

在这里，我们提供了一个协议来衡量C.氧化应激性线虫在液体中。简言之，将ROS诱导试剂如百草枯（PQ）和H _{2 O 2}溶解在M9缓冲液中，溶液等分在96孔微量滴定板的孔中。同步L4 /年轻的成年C.线虫动物被转移到孔中（5-8只动物/孔）和存活测定每隔一小时，直到大部分的蠕虫都死了。当使用在板的压力源的低浓度，老化可能会影响在氧化应激的动物，这可能导致不正确的数据的解释的行为进行了氧化应激抗性测试。然而，在本文描述的测定中，这个问题不太可能发生，因为只L4 /年轻的成年动物的使用情况。此外，该协议是廉价且结果在一天，这使得该技术对于遗传筛选吸引力获得。总的来说，这将有助于理解氧化应激信号传导途径，其可以转化成氧化应激相关的人类疾病更好表征。

引言

在真核生物中，氧化磷酸化发生在线粒体的电子传递链是能源生产中ATP形式的主要驱动力。活性氧（ROS）是这一进程的一个天然副产品。尽管它们作为信号分子的重要作用，过量的ROS可导致DNA损伤，蛋白质的羰基化和脂质氧化。 ROS产生和解毒之间的不平衡引起的氧化应激，从而导致能量消耗，细胞损伤，并触发细胞死亡^1,2。氧化应激促成老化和许多威胁生命的疾病，包括癌症，糖尿病，心血管疾病和神经变性疾病^3-9的发展。

细胞进化的酶和非酶防御战略，以保持适当的ROS水平，并保护他们的选民免受氧化损伤^1,2。超氧化物歧化酶（SOD）酶首先采取行动，便利着想室温超氧成H ₂ O _2，这将在后面转化为水通过过氧化氢 ​​酶或过氧化物酶。非酶促防御策略主要包括反应的速度与ROS相比，细胞大分子，保护重要的细胞成分的分子。尽管ROS解毒酶的保护作用，一些活性氧分子逃避抗氧化防御机制，导致氧化损伤。检测，修理，和受损的细胞成分的降解是氧化应激^1,2-期间必需防御策略。

信号参与抗逆性和具体氧化应激的途径是高度进化保守^10,11。与细胞培养实验中有机体的条件只有部分转载，氧化应激在模式生物^12,13具有重要的意义的研究。C.线虫是一种自由生活的线虫，可以容易且廉价地尽头捕获的原始图像上的菌苔上的琼脂培养基。它的尺寸小（约1毫米长），并通常生长作为自我施肥雌雄同体，这有利于遗传操作。它有一个快速的生命周期和较高的繁殖能力，生产每代300的后代，使之成为一个强大的工具来执行大规模的遗传筛选^14。 C.该线虫基因组被完全测序和基因的40-50％被预测为人类疾病相关的基因^15-18的同系物。利用RNA干扰目的基因的敲除快速，容易C.线虫。基因下调可通过饲养动物的大肠杆菌可以实现杆菌细菌窝藏表达靶向感兴趣¹⁹的mRNA表达的双链RNA的质粒。因此，确定采用大规模RNAi筛选基因的功能，对了解人类疾病，包括癌症^20,21很大的影响。

邻研究在C xidative抗逆性线虫已经导致电阻的保守机制的鉴定对氧化应激^13,22。确定了一些途径是调节长寿和耐其它应力以及如缺氧，热和渗透胁迫共同通路。这些途径包括胰岛素信号，TOR信令，和自噬。其他主要途径包括ROS的解毒，如超氧化物歧化酶酶和过氧化氢 ​​酶，或损伤修复，如热休克和伴侣蛋白^11,13,22。

这个协议描述了如何确定到C的氧化应激的抗性线虫在液体中。我们使用FLCN-1（ok975）和野生型动物表现出的协议，因为我们先前在C时的损失示于氧化应激的抗性增加FLCN-1（ok975）线虫 ^23。我们还表明，这种增加的电阻取决于对AMPK和自噬，信令轴，提高了细胞生物能量，促进抗逆性^23。 PQ是氧化应激，与电子传递链，以产生活性氧²⁴干扰。相同的测定可以适于和其他活性氧源或活性氧生成的化合物可以使用如H _{2 O 2}和鱼藤酮。类似测定法已开发上，其中低浓度PQ的使用^25,26板。该测定的优点在于，它是非常快，其结果可能会在一天内获得。此外，液用于在96孔板进行氧化应激抗性测试的总体积是低相比，用于制备含PQ板的体积。因此，PQ的用量是在液体中测定低，这使得该测定便宜并限制生产有毒废料。然而，该测定的相比，板测定法限制包括拉食物中的液体化验和氧气在液体中的低浓度的放相比于空气。这些是在某些情况下，可能会影响结果的重要因素。因此，在使用的氧化应激抗性的其它方法，推荐以支持在该测定中获得的结果，确认再现性。

研究方案

1.准备试剂

1. 为C.制备的媒体线虫的生长（在这种情况下，野生型动物和FLCN-1（ok975）突变体动物）。
   1. 制备改性含5.5克的Tris盐酸2.4克Tris碱的，31克Bactopetone，20克氯化钠和0.08克胆甾醇的Youngren的只有细菌用蛋白胨（智管）干混。摇动拌匀。
      注:这样的搭配足以准备10升MYOB介质。
      注:正常生长培养基（NGM）板可用于智管板²⁷代替。然而，应该用于菌株之间和独立重复之间有效的比较相同类型的板。在这个协议中，我们只用了MYOB板。
   2. 制备1升智管培养基中加入6克智管干混17克琼脂和补至1L用H ₂ O和高压釜中在122℃下45分钟。倒板，让干在室温2天。
   3. 使用无菌技术，接种百毫升文化前进的再与E. LB肉汤培养基大肠杆菌 OP50细菌和长出O / N在37℃。
   4. MYOB种子板的E.大肠杆菌 OP50细菌。允许它生长在室温48小时。
2. 利用RNA干扰基因下调准备
   1. MYOB准备RNA干扰喂养板。请按照步骤1.1.1和1.1.2。高压灭菌后，允许该介质冷却至约55℃并加入1 ml的1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和1ml 100mM的氨苄青霉素。
   2. E.连胜大肠杆菌 HT115细菌的质粒转化，其表达或者控制的EV或FLCN-1特异性RNAi对氨苄青霉素（50微克/毫升）/四环素（15微克/毫升）的琼脂板上。成长的文化O / N在37℃。
   3. 挑选菌落，接种E.大肠杆菌 HT115细菌的质粒转化其表达或者控制的EV或FLCN-1特异性RNAi和在LB /氨苄青霉素（50微克/毫升）中，O / N在37＃生长培养176℃。
   4. 种子板块与E.大肠杆菌 HT115 EV细菌或HT115 FLCN-1 RNA干扰细菌。
      注意:保持板48小时，在RT使用前。如果RNAi敲低被馈送是在有效，使用递送的双链RNA的²⁸的其他方法。
3. 使用诱导百草枯（PQ）氧化应激:
   1. 制备M9的缓冲区通过混合的KH ₂ 3克PO _4，6克的Na ₂ HPO _4，5克氯化钠和0.25g硫酸镁_4·7 H ₂ O调出到1L蒸馏水。为在122℃和存储瓶在室温45分钟的高压釜溶液。
   2. 在测定当天，制备含PQ的M9 /溶液。对于这个协议，使用100毫米PQ（0.1028克PQ溶于4毫升M9缓冲填满整个96孔板40微升每孔M9 / PQ的）。
      注意:PQ是一个危险和剧毒化合物。根据适当的准则处理。
      注:当第一次运行新的S火车或一个新的条件，建议测定生存PQ增加浓度来确定，以便在7-10小时杀死动物，用最好的浓度。

2.准备工作年龄同步L4人口

1. 转让20妊娠成人雌雄同体到一个新的MYOB板接种E.大肠杆菌 OP50细菌。备基于所述测定期间所需要的蠕虫数目几个平板。
2. 让他们产卵6小时，然后使用铂丝挑虫取出母亲。检查在显微镜下将板以评估产卵的数量。
3. 让鸡蛋孵化，成长在20℃48小时。此时，将动物处于晚期L4 /年轻的成年阶段。挑同一阶段的动物和转移到PQ含有溶液的孔中。
   注意:由于48小时温育仅适用于生长类似于野生型动物的突变体，其监视与发育是重要新测试的突变体的速率，以确保它符合野生型发育率，否则，其它时间轴应使用。
4. 另外，使用同步技术。生成的使用次氯酸盐溶液的L1幼虫蠕虫同步人口（25毫升水中125毫升5.25％的次氯酸钠，加入50ml 4M氢氧化钠;包裹瓶用铝箔避光隔离）。然而，对于该测定，它是不推荐的，因为强烈的漂白可能影响测定期间的动物的行为。
   注意:根据指引处理次氯酸钠溶液。
   注:使用RNA干扰下调目的基因，如第2节，除了母亲转移到播种的特异性RNAi细菌RNA干扰板同步雌雄同体。当与RNA干扰击倒较弱，建议饲养多代。

3.执行氧化胁迫的抗性测试

1. 吸管40微升100mM的PQ溶液（新鲜制备），以96孔板的每孔的。使用至少12口井为每复制条件（治疗，突变等 ）。使用铂丝虫拾取，转移5-8 L4幼虫动物每孔指示的开始时间和结束时间。
2. 当开始另一个条件，请注意的开始时间和结束时间。将板在20℃在一小时后从开始时间传送所述蠕虫和得分死动物之间的温育时间。
3. 使用解剖显微镜，算上每生存小时。在开始之前，计数轻轻摇动板。表明蠕虫不动，甚至看上一个高强度的光后，为死去的动物。也表明动物存活的数量。
   注:纵观蠕虫状，尾巴和头部运动在高放大倍率，帮助确定由活着死虫。
4. 直到大部分的蠕虫都死了每小时重复此步骤。

4。在各时间点测定存活率

1. 通过添加传送到每一个井动物的总数计算出每条件的动物的总数。忽略损坏或转让时被杀的动物。
2. 对于每一个时间点，计算死亡的动物的每种条件的总数（死的动物中的12个孔和）。对于每一个时间点上，计算死亡的百分比和存活（100减去百分之死亡）百分比（死亡动物100通过动物的总数除以并乘以数）。
3. 重复该测定的至少3个独立的倍。

结果

比较野生型C.线虫到FLCN-1（ok975）突变体动物

在这里，我们使用100毫PQ，以确定野生型C的电阻线虫相比FLCN-1（ok975）动物已显示抗氧化应激，热和缺氧^23。 4小时的治疗，野生型的48.3％后存活相比77.8％的存活率在FLCN-1（ok975）动物。正如所料，FLCN-1（ok975）突变体动物是更耐至100mM PQ相比野生型（ 图2和表1...

讨论

线虫是一个有吸引力的模式生物研究体内基因氧化应激抗性，因为它可以很容易地进行培养，并迅速导致大量基因完全相同的后代。多种方法来测量氧化应激抗性先前已经描述和它们是基于培养板与各种活性氧源如PQ，鱼藤酮，过_氧化氢 ​​，和胡桃醌^25,26,29-32的补充。在这里，我们描述了一种协议，用于测量氧化应激抗性在液体中使用100mM的PQ 96孔板中。类似的试?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library