Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Резюме

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Аннотация

Окислительный стресс, который является результатом дисбаланса между производством и детоксикации активных форм кислорода, является одной из основных причин хронических заболеваний у человека, в том числе сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, диабета, старения и рака. Таким образом, важно, чтобы изучить окислительный стресс не только в клеточных системах, но и с помощью целых организмов. С. Элеганс является привлекательной моделью организм изучать генетику окислительных трансдукции сигнала напряжения, которые высоко эволюционно консервативных.

Здесь мы предоставляем протокол для измерения окислительного стрессоустойчивости С. Элеганс в жидкости. Вкратце, РОС-индуцирующие реагенты, такие как паракват (PQ) и H ₂ O ₂ растворяют в буфере M9, и аликвоты растворов в лунках микротитрационного планшета 96 скважины. Синхронное L4 / молодой взрослый С. Элеганс животные передаются в лунки (5-8 животных / а) и выживание измеряетсякаждый час до тех пор, большинство червей не мертвы. При выполнении окислительный стресс сопротивления анализа с использованием низкой концентрации стресса в пластинах, старение может повлиять на поведение животных После окислительного стресса, который может привести к неправильной интерпретации данных. Тем не менее, в исследовании, описанном в данном документе, эта проблема вряд ли произойдет, поскольку используются только L4 / молодых взрослых животных. Кроме того, этот протокол является недорогим и результаты получены в один день, что делает эту технику привлекательной для генетических экранов. В целом, это поможет понять, окислительные пути сигнала напряжение трансдукции, которые могут быть переведены на более характеристик окислительного стресса связанный человека заболеваний.

Введение

У эукариот, окислительного фосфорилирования происходит в электрон-транспортной цепи митохондрий является основным фактором производства энергии в форме АТФ. Активные формы кислорода (АФК) являются естественным побочным продуктом этого процесса. Несмотря на их важную роль в качестве сигнальных молекул, чрезмерное АФК может привести к повреждению ДНК, белков карбонилирования и окисления липидов. Дисбаланс между АФК и детоксикации вызывает окислительный стресс, что приводит к истощению энергии, клеточных повреждений, и запускает клеточную гибель ^1,2. Окислительный стресс способствует старению и развитию многих угрожающих жизни заболеваний, включая рак, диабет, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания ^3-9.

Клетки развивались ферментативные и неферментативные стратегии защиты, чтобы поддерживать надлежащий уровень АФК и защитить своих избирателей от окислительного повреждения ^1,2. Супероксиддисмутазы (СОД) ферменты действуют первым удобстRT супероксид-Н ₂ О _2, который затем преобразуется в воде каталазы или пероксидазы ферментов. Номера ферментативные оборонные стратегии включают в себя в основном молекулы, которые реагируют быстрее с АФК по сравнению с клеточными макромолекулами, защищающих основные клеточные компоненты. Несмотря на защитной роли АФК детоксикации ферменты, некоторые молекулы АФК избежать антиоксидантными защитные механизмы и привести к окислительному повреждению. Обнаружение, ремонт и деградация поврежденных клеточных компонентов основных стратегий защиты во время окислительного стресса ^1,2.

Сигнальных путей, участвующих в стрессоустойчивости и специально окислительного стресса высоко эволюционно консервативны ^10,11. В отличие от экспериментов культивирования клеток, где организменном условия лишь частично воспроизведена, исследования окислительного стресса в модельных организмов ^12,13 имеет большое значение. С Элеганс является свободно живущих нематод, которые могут быть легко и недорого культывается на бактериальной газон на агаре. Это небольшой по размеру (около 1 мм в длину) и нормально растет в качестве самостоятельного удобрения гермафродита, что облегчает генетические манипуляции. Он имеет быстрый жизненный цикл и высокую репродуктивную способность, производя около 300 потомков на поколение, что делает его мощным инструментом для выполнения масштабных генетических экраны ^14. С. Элеганс генома полностью секвенировали и 40-50% генов, по прогнозам, будет гомологов болезни генов, ассоциированных с человека ^15-18. Нокдаун генов интерес, используя RNAi является быстрым и легким в С. Элеганс. Джин вниз регулирование может быть достигнуто путем кормления животных Е. палочки бактерии, которые укрывают плазмиды, выражающее двухцепочечной РНК, которая нацелена на мРНК интерес ^19. Таким образом, определение функции генов с использованием крупномасштабных RNAi экраны имеет большое влияние на понимание заболеваний человека, включая рак ^20,21.

Исследования Oxidative стрессоустойчивость в С. Элеганс привели к идентификации консервативных механизмов резистентности к окислительному стрессу ^13,22. Некоторые пути, выявленные общие пути, которые модулируют долговечность и устойчивость к другим стрессам, а также такие, как гипоксия, тепло, и осмотического стресса. Эти пути включают в себя секрецию инсулина, сигнализации TOR, и аутофагии. Другие ключевые пути привлечь детоксикации АФК, таких как супероксиддисмутаза ферментов и каталазы ферментов, или в репарации повреждений, таких как теплового шока и белков-шаперонов ^11,13,22.

Этот протокол описывает, как определить устойчивость к окислительному стрессу С. Элеганс в жидкости. Мы использовали flcn-1 (ok975) и животных дикого типа, чтобы продемонстрировать протокол, так как мы показали ранее повышенную устойчивость к окислительному стрессу при потере flcn-1 (ok975) на C. Элеганс ^23. Мы также показали, что повышенное сопротивление зависитна AMPK и аутофагии, оси сигнализации, что повышает клеточный биоэнергетику и способствует стрессоустойчивости ^23. PQ является окислительный стресс, который влияет на электрон-транспортной цепи для производства видов реактивного кислорода ^24. Анализ же могут быть адаптированы и другие источники ROS ROS или генерирующие соединения могут быть использованы, например, H ₂ O ₂ и ротенона. Аналогичные анализы были разработаны на пластинах, где низкие концентрации PQ используются ^25,26. Преимущество такого анализа является то, что очень быстро, а результаты могут быть получены в один день. Кроме того, общий объем жидкости, используемой для выполнения окислительный стресс-устойчивости анализа в 96-луночных планшетах является низкой по сравнению с объемом, используемого для получения PQ-содержащие пластины. Таким образом, количество PQ используется в жидком тесте низкий, что делает этот анализ недорого и ограничивает производство токсичных отходов. Однако ограничения данного анализа по сравнению с пластинчатыми анализов включают ЛАCK пищи в жидком тесте и низкой концентрации кислорода в жидкости по сравнению с воздухом. Они являются важными факторами, которые в некоторых случаях, может повлиять на результаты. Таким образом, подтверждающие воспроизводимость с помощью других методов окислительного стресса сопротивления рекомендуется, чтобы поддержать результаты, полученные в этом тесте.

протокол

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка средств массовой информации для С. Рост Элеганс (в данном случае, животных дикого типа и flcn-1 (ok975) мутантных животных).
   1. Готовят изменены только Бакто-пептон (грецкий) сухой смеси, содержащей Youngren 5,5 г Трис HCl, 2,4 г трис-основани, 31 г Bactopetone, 20 г NaCl и 0,08 г холестерина. Хорошо перемешать, встряхивая.
      Примечание: Эта смесь является достаточным для получения 10 л MYOB среды.
      Примечание: Нормальные ростовую среду (НГМ) пластины может быть использован вместо грецкий пластин ^27. Тем не менее, тот же тип пластины должны быть использованы для сравнения между действительными и штаммов между независимыми повторами. В этом протоколе, мы использовали только грецкий пластины.
   2. Подготовка 1 л MYOB среды путем добавления 6 г MYOB сухой смеси, 17 г агара и составляют до 1 л Н ₂ О и автоклав в течение 45 мин при 122 ° С. Налейте пластин и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 2 дней.
   3. Использование стерильных, привить 100 мл cultuRe Л.Б. бульона среде с Е. палочка OP50 бактерии и расти O / N на 37 ° C.
   4. Семя MYOB пластины с Е. палочка OP50 бактерий. Позвольте ему расти при комнатной температуре в течение 48 ч.
2. Подготовка к генной подавлением с использованием RNAi
   1. Подготовка грецкий РНК-интерференции кормления пластины. Действуйте, как в шагах 1.1.1 и 1.1.2. После автоклавирования среда позволяют охладиться до приблизительно 55 ° С и добавляют 1 мл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и 1 мл 100 мМ ампициллина.
   2. Е. подряд палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая экспрессирует либо управления EV или flcn-1 специфический RNAi на ампициллин (50 мкг / мл) / тетрациклин (15 мкг / мл) чашки с агаром. Выращивают культуры O / N при 37 ° С.
   3. Выберите колонии и привить Е. палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая выражает либо контроля Е.В. или flcn-1 РНК-интерференции конкретных и расти культуры в LB / ампициллин (50 мкг / мл) средних и O / N в 37 & #176; С.
   4. Семенной пластин с Е. палочка HT115 EV бактерии или HT115 flcn-1 RNAi бактерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластины 48 ч при комнатной температуре перед использованием. Если РНК-интерференции нокдаун от кормления в эффективной, использовать другие методы доставки DS-РНК ^28.
3. Стимулирование окислительный стресс, используя параквата (PQ):
   1. Подготовьте M9 буфер путем смешивания 3 г КН ₂ РО _4, 6 г Na ₂ HPO _4, 5 г NaCl и 0,25 г MgSO ₄ · 7Н ₂ О. Принесите до 1 л дистиллированной воды. Автоклав раствор в течение 45 мин при 122 ° С и хранить при комнатной температуре бутылок.
   2. В день анализа, подготовить M9 / PQ-содержащий раствор. Для этого протокола, используйте 100 мМ PQ (0,1028 г PQ, растворенного в 4 мл M9 буфера заполняет весь 96-луночных с 40 мкл / M9 PQ на лунку).
      ВНИМАНИЕ: PQ является опасным и очень токсичен. Обращайтесь в соответствии с соответствующими руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При первом запуске новых Sпоезд или новое состояние, рекомендуется для анализа выживаемости в увеличении концентрации PQ, чтобы определить наилучший концентрации, чтобы использовать для того, чтобы убить животных в 7-10 ч.

2. Подготовка Возраст синхронизированной L4 населения

1. Передача 20 беременных взрослых гермафродитов на свежий MYOB пластины засеянного Е. палочка OP50 бактерий. Подготовьте несколько пластин в зависимости от количества червей, необходимых в процессе анализа.
2. Позвольте им, чтобы отложить яйца в течение 6 ч, а затем с помощью платиновой проволоки червя выбрать Удалить матерей. Проверьте пластины под микроскопом, чтобы определить количество яиц.
3. Разрешить яйца в люк и расти при 20 ° С в течение 48 ч. В это время, животные в конце L4 / молодой взрослой стадии. Выберите те же стадии животных и передать на PQ решений, содержащих скважин.
   Примечание: С 48 ч инкубации относится только к мутантам, которые растут так же, как у животных дикого типа, важно контролировать развитияСкорость недавно протестированных мутантов, чтобы обеспечить его соответствие темпов развития дикого типа, в противном случае, другие сроки должны быть использованы.
4. Кроме того, использование методов синхронизации. Генерация синхронизированный население L1 личинок червей с использованием гипохлорита раствор (25 мл воды, 125 мл 5,25% раствора гипохлорита натрия, 50 мл 4 М NaOH; обернуть бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы изолировать от света). Тем не менее, для этого анализа, не рекомендуется, так как интенсивное отбеливание может повлиять на поведение животных во время теста.
   ВНИМАНИЕ: Обращайтесь раствор гипохлорита в соответствии с руководящими принципами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании RNAi вниз регулировать интерес ген, синхронизировать гермафродитов, как описано в разделе 2, за исключением передачи матерей к РНК-интерференции пластин, посеянных с конкретными бактерий РНК-интерференции. Когда нокдаун с РНК-интерференции является слабым, кормление нескольких поколений рекомендуется.

3. Выполнение окислительного стресса Сопротивление Пробирной

1. Пипетка 40 мкл раствора мМ PQ 100 (полученного свежего) к каждой лунке 96-луночного планшета. Используйте по крайней мере 12 скважин, как повторяет каждого условия (лечения, мутанта, и т.д.). Использование платиновой проволоки червя выбор, передать 5-8 L4 личинок животных в каждую лунку с указанием времени начала и время окончания.
2. При запуске еще одно условие, обратите внимание на время начала и время окончания. Поместите пластину на 20 ° C во время инкубации между передачи червей и забил мертвых животных через час с момента старта.
3. Использование рассекает микроскоп, рассчитывать выживания каждый час. Слегка встряхните пластину, прежде чем начать рассчитывать. Укажите червей, которые не двигаются, даже после кровянистые выделения свет высокой интенсивности, а мертвых животных. Также укажите количество животных в живых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя на форму червя, хвосты и движения головы при сильном увеличении, поможет определить мертвые черви из живых.
4. Повторите этот шаг каждый час, пока большинство червей не мертвы.

<р = класс "jove_title"> 4. Определение выживания Процент на каждый момент времени

1. Рассчитать общее количество животных на каждое условие, добавив общее количество животных, передаваемых в каждую лунку. Не обращайте внимания на животных, которые были повреждены или погибли при передаче.
2. Для каждого момента времени, вычислить общее количество погибших животных на каждое условие (сумма мертвых животных в 12 лунок). Для каждого момента времени, расчета процент смерти (число умерших животных, поделенное на общее число животных и умноженное на 100) и процент выживаемости (100 минус процент смерти).
3. Повторите этот анализ не менее 3 независимых раза.

Результаты

Сравнивая дикого типа С. Элеганс, чтобы flcn-1 (ok975) мутантных животных

Здесь мы использовали 100 мМ PQ для определения сопротивления дикого типа C. Элеганс животных по сравнению с flcn-1 (ok975), который, как было показано, чтобы противостоять окислительного стрес...

Обсуждение

C. Элеганс является привлекательным модельный организм для изучения генетически окислительный стресс устойчивость в естественных условиях, так как он может быть легко культивировать, и быстро приводит к большому количеству генетически идентичных потомков. Различные способ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library