의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

요약

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

초록

생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다.

여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H ₂ O ₂ 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 ^사멸을 유발 ^1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 ^3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다.

ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 ^1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H ₂ O _2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 활성 산소 분자는 항산화 방어 메커니즘을 탈출 및 산화 적 손상을 초래할. 감지, 복구 및 손상된 세포 성분의 저하는 산화 스트레스 ^1,2시 필수적인 방어 전략이다.

스트레스 저항 특히 산화 스트레스에 관여하는 신호 전달 경로 것은 매우 진화 ^{(10, 11)를} 보존하고 있습니다. 생명체의 조건이 부분적으로 만 재생되는 세포 배양 실험, ^{12, 13은} 큰 의미를 가지고 모델 생물에서 산화 스트레스의 연구와는 달리. C. 엘레는 막 다른 쉽고 저렴하게 할 수있는 자유 생활 선충이다한천 매체에 세균 잔디밭에 냈다는. 그것은 크기가 작고 일반적으로 (약 1 길이 ㎜) 및 유전자 조작을 용이하게하는 자기 시비 자웅 동체로 성장한다. 그것은 빠른 라이프 사이클과 높은 생식 능력, 세대 당 약 300 자손을 생산하고 그것을 대규모 유전 스크린 ^(14)을 수행 할 수있는 강력한 도구를하고있다. C. elegans의 게놈 염기 서열을 완전히하고 유전자 40-50 %가 인간의 질병 관련 유전자 ^{15 ~ 18의} 동체가 될 것으로 예상된다. 의 RNAi를 사용하여 관심의 유전자의 최저 신속하고 C에서 쉽게 엘레. 유전자 다운 조절은 E. 동물을 공급함으로써 달성 될 수있다 관심 ^19의 mRNA를 표적의 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드를 대장균 박테리아 항구. 따라서, 대규모의 RNAi 스크린을 이용한 유전자 기능의 결정은 암 ^{(20, 21)을} 포함하여 인간의 질병을 이해하는데 큰 영향을 미친다.

O의 연구C에서 xidative 스트레스 저항 엘레은 산화 스트레스 ^13,22에 대한 저항의 보존 메커니즘의 식별을 주도했다. 확인 된 일부 경로는 저산소증, 열, 삼투압 스트레스 같은 다른 스트레스뿐만 아니라 이러한 장수와 저항을 조절하는 일반적인 경로이다. 이 경로는 인슐린 신호, TOR 신호, 그리고 자식 작용을 포함한다. 다른 주요 경로는, 또는 손상의 수리 등의 열 충격 및 보호자 단백질 ^11,13,22 같은 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 효소와 카탈라아제 효소로 활성 산소의 해독을 포함한다.

이 프로토콜은 C의 산화 적 스트레스에 대한 저항을 확인하는 방법에 대해 설명합니다 액체에 간스. 우리는 이전에 C. 손실시 flcn -1- (ok975)를 산화 적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 보여 주었다 때문에 우리는 프로토콜을 설명하기 flcn -1- (ok975) 및 야생형 동물을 사용 엘레 ^(23). 우리는 또한이 증가 저항이 달려 있음을 보여 주었다AMPK와 자식 작용, 세포 생체 에너지를 향상시키고 응력 저항 ^(23)을 촉진 시그널링 축. PQ는 반응성 산소 종 ^(24)를 생성하기 위해 전자 전달계를 방해 산화성 스트레스이다. 같은 분석은 적용 할 수 있고, 다른 ROS 소스 또는 활성 산소 생성 화합물은 H ₂ O _2와 로테 논 등 사용할 수 있습니다. 유사한 분석은 PQ의 낮은 농도 ^{(25, 26)를} 사용하는 플레이트에 개발되어왔다. 이 분석의 장점은 매우 빠르고, 그 결과는 하루에 획득 될 수 있다는 것이다. 또한, 96 웰 플레이트에서 산화 적 스트레스 저항성 검정을 수행하는 데 사용되는 액체의 총량은 PQ - 함유 플레이트를 제조하는 데 사용되는 체적에 비해 낮다. 따라서, 사용 된 PQ의 양이 분석에서 액체 인 것은 저가 분석을 렌더링하고 유해 폐기물의 생성을 제한하는 낮다. 그러나, 플레이트 분석에 비해이 분석의 한계 라 포함액체 분석에서 음식과 액체 산소의 낮은 농도의 CK는 공기에 비해. 이러한 경우에, 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 따라서,이 분석에서 얻어진 결과를 지원하기 위해 권장 산화 스트레스 저항성 다른 방법을 사용하여 재현성을 확인하기.

프로토콜

시약 1. 준비

1. C의 미디어의 준비 (이 경우, 야생형 동물과 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물) 간스 성장.
   1. 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다.
      참고 :이 믹스 참견 마라 매체의 10 L를 준비하기에 충분하다.
      주 : 정상적인 성장 매체 (NGM) 판 참견 마라 판 ⁽²⁷⁾ 대신에 사용될 수있다. 그러나 판의 동일한 유형 균주간에 독립적 반복 사이의 유효한 비교를 위해 사용되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 참견 마라 판을 사용했다.
   2. 참견 마라 건조 믹스 6g, 한천 17g을 추가하여 참견 마라 매체의 1 리터를 준비하고 122 ℃에서 45 분 동안 H ₂ O 및 오토 클레이브와 1 L로 구성한다. 판을 붓고 실온에서 2 일 동안 건조 할 수 있습니다.
   3. 멸균 기법을 사용 cultu 100 ㎖에 접종E.와 LB 국물 매체의 재 대장균 OP50 박테리아 및 37 ℃에서 O / N 성장.
   4. E.와 씨앗 참견 마라 판 대장균 OP50 박테리아. 그것은 48 시간 동안 실온에서 성장하도록 허용합니다.
2. 의 RNAi를 사용하여 유전자의 하향 조절을위한 준비
   1. 참견 마라의 RNAi 수유 판을 준비합니다. 단계 1.1.1과 1.1.2에서와 같이 진행합니다. 오토 클레이브 후, 배지는 약 55 ℃로 냉각하고 추가 할 수있는 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG), 100 mM의 암피실린 1 ㎖를 1 ㎖.
   2. 킬 E. 콜라이 HT115 제어 EV 또는 한천 플레이트에 암피실린 flcn -1- 특정의 RNAi (50 μg의 / ㎖) / 테트라 사이클린 (15 μg의 / ㎖)를 발현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아. 37 ° C에서 문화 O / N 성장.
   3. 식민지를 선택하고 E. 접종 대장균 HT115 제어 EV 또는 특정의 RNAi-1 flcn과 하나가 37 & #에서 LB / 암피실린 (50 μg의 / ㎖) 매체와 O / N에서 문화를 성장 표현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아를176; C.
   4. E.와 씨앗 판 대장균 HT115 EV 세균이나 HT115 flcn-1 RNAi의 세균.
      참고 : 사용하기 전에 실온에서 판을 48 시간 유지. 공급하여 RNAi의 최저 유효 인 경우, ^DS-28의 RNA 전달하는 다른 방법을 사용한다.
3. 파라콰트 (PQ)를 사용하여 산화 스트레스를 유도 :
   1. KH ₂ PO ₄ 3g을 혼합하여 M9 버퍼를 준비 나 _2의 6g HPO _4, 염화나트륨 5 g 및 _황산 0.25 g · 7 H ₂ O. 증류수 1 L에 불러옵니다. 실온에서 122 ° C와 저장 병에서 45 분간 고압 솔루션입니다.
   2. 분석 당일, M9 / PQ - 함유 용액을 제조 하였다. (M9 버퍼의 4 ㎖에 녹이고 PQ의 0.1028 g을 잘 당 M9 / PQ의 40 μL로 전체 96 웰 플레이트를 채우고)이 프로토콜의 경우, 100 mM의 PQ를 사용합니다.
      주의 : PQ는 위험하고 독성이 강한 화합물이다. 해당 지침에 따라 처리합니다.
      참고 : 때 먼저 새의 실행기차 또는 새 조건, 그것은 7-10 시간 내에 동물을 죽일하기 위해 사용하는 가장 농도를 결정하기 위해 PQ의 농도를 증가에서 생존을 분석하는 것이 좋습니다.

나이 동기 L4 인구 2. 준비

1. E. 시드 신선한 참견 마라 플레이트로 전송 20 임신하는 성인 자웅 동체를 대장균 OP50 박테리아. 분석시 필요한 웜의 수에 따라 몇 접시를 준비합니다.
2. 그들이 6 시간 후, 어머니를 제거 백금 와이어 웜을 선택 사용하는 알을 낳는하도록 허용합니다. 누워 계란의 수를 평가하기 위해 현미경으로 번호판을 확인합니다.
3. 알이 부화하고 48 시간 동안 20 ℃에서 성장하도록 허용합니다. 이 시점에서, 동물은 늦은 L4 / 젊은 성인 단계에있다. 같은 무대 동물을 선택하고 PQ 솔루션 함유 우물에 전송할 수 있습니다.
   참고 : 48 시간 배양 단지 야생형 동물과 유사 성장 돌연변이에 적용하므로,이 발달 모니터링하는 것은 중요새로 테스트 돌연변이 비율은, 야생형 개발 레이트 그렇지 다른 타임 라인이 사용되어야 부합되도록한다.
4. 대안 적으로, 동기화 기술을 사용한다. 차아 염소산 용액을 사용하여 L1 유충 웜의 동기 인구 생성 (25 ml의 물, 5.25 %의 차아 염소산 나트륨의 125 ml의 4 M의 NaOH 50 mL로, 빛에서 분리하기 위해 알루미늄 호일로 병 포장). 강렬한 표백 분석 중에 동물의 행동에 영향을 줄 수 있기 때문에,이 분석을 위해, 그것은, 권장되지 않는다.
   주의 : 지침에 따라 차아 염소산 용액을 처리합니다.
   주 : 다운, 관심 유전자를 조절하는 특정 세균의 RNAi 시드 RNAi의 플레이트에 산모 전사 제외한 제 2 절에 설명 자웅 동체를 동기화 RNAi의 사용시. RNAi에와 최저 약한 경우, 여러 세대에 공급하는 것이 좋습니다.

3. 산화 스트레스 저항 분석을 <공연/ P>

1. 피펫 96 웰 플레이트의 각 웰에 (신선한 제조) 100 mM의 PQ 용액 40 μL. 모든 조건 (치료, 돌연변이 등)의 복제로 최소 12 우물을 사용합니다. 백금선 웜 픽업을 사용하여, 각 웰은 시작 시간과 종료 시간을 나타내는 5-8 L4 유충 동물 옮긴다.
2. 다른 조건을 시작할 때, 시작 시간 및 종료 시간을 참고. 시작 시간에서 한 시간 후에 죽은 동물을 벌레를 전송하고 점수 사이의 배양 시간에 20 ° C에서 접시를 놓습니다.
3. 해부 현미경을 사용하여, 생존마다 시간을 계산합니다. 조심스럽게 계산을 시작하기 전에 판을 흔들. 죽은 동물로, 심지어 높은 강도의 광을 스폿 팅 한 후에, 이동하지 않은 웜을 표시한다. 또한, 살아있는 동물의 수를 나타낸다.
   참고 : 높은 배율에서 벌레 모양, 꼬리와 머리의 움직임을 보면, 살아에서 죽은 벌레를 결정하는 데 도움을줍니다.
4. 대부분의 벌레가 죽을 때까지이 단계마다 시간을 반복합니다.

4. 모든 시간 시점에서 생존 비율의 결정

1. 물론 모든 동물에 전송의 총 수를 가산함으로써 조건 당 동물의 총 수를 계산한다. 손상 또는 이전에 사망 동물을 무시합니다.
2. 매 시간 포인트 (12 웰에서 죽은 동물의 합) 조건 당 죽은 동물의 총 수를 계산한다. 때마다 포인트, 생존 (100 마이너스 %의 죽음)의 비율 (죽은 동물 (100)에 의해 동물의 총 개수로 나눈 값과 곱의 수) 죽음의 비율을 계산합니다.
3. 이 분석을 최소 3 독립 번 반복합니다.

결과

비교 야생형 C. 엘레은 flcn-1 (ok975) 돌연변이 동물

여기서 우리는 야생형 C.의 저항을 결정하기 위해 100 밀리미터 PQ 사용 산화 스트레스, 열, 산소 결핍 ^{(23)에 저항하는} 것으로 나타났다 flcn -1- (ok975)에 비해 간스 동물. 치료 4 시간, 야생형의 48.3 % 이후 생존으로 flcn-1 (ok975) 동물에서 77.8 %의 생존에 비해. 예상대로, flcn -1- (ok975) 돌...

토론

C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H ₂ O _2, 및 juglone ^25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library