Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Resumo

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Resumo

O stress oxidativo, que é o resultado de um desequilíbrio entre a produção e a desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio, é um dos principais contribuintes para doenças humanas crónicas, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes, envelhecimento e cancro. Portanto, é importante para estudar o stress oxidativo, não só em sistemas de células, mas também utilizando organismos inteiros. C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar a genética de vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que são altamente conservadas evolutivamente.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para medir a resistência ao estresse oxidativo em C. elegans em líquido. Reagentes Resumidamente, ROS-indutores, tais como paraquato (PQ) e H ₂ O ₂ são dissolvidos em tampão M9, e soluções são aliquotadas em cavidades de uma placa de microtitulação de 96 poços. L4 sincronizado / adulto jovem C. elegans animais são transferidos para os poços (5-8 animais / poço) e é medida a sobrevivênciaa cada hora até que a maioria dos worms estão mortos. Ao realizar um ensaio de resistência ao estresse oxidativo utilizando uma baixa concentração de estressores em placas, o envelhecimento pode influenciar o comportamento dos animais sobre o estresse oxidativo, o que poderia levar a uma interpretação incorrecta dos dados. No entanto, no ensaio aqui descrito, este problema é improvável de ocorrer uma vez que apenas L4 / animais adultos, jovens estão sendo usados. Além disso, este protocolo é barato e resultados são obtidos em um dia, o que torna esta técnica atraente para telas genéticos. No geral, isso irá ajudar a compreender vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que poderia ser traduzido em melhor caracterização de doenças humanas associadas a estresse oxidativo.

Introdução

Em eucariotas, fosforilação oxidativa ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria é o principal motor da produção de energia na forma de ATP. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um subproduto natural do processo. Apesar do seu importante papel como moléculas de sinalização, excessiva de ROS pode levar a danos no ADN, carbonilação de proteínas, e a oxidação de lípidos. Um desequilíbrio entre a produção de ROS e desintoxicação faz com que o stress oxidativo, o que conduz à depleção da energia, lesão celular, e provoca a morte celular ^1,2. O estresse oxidativo contribui para o envelhecimento e para o desenvolvimento de muitas doenças potencialmente fatais, incluindo câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas ^3-9.

As células desenvolveram estratégias de defesa enzimáticos e não enzimáticos para manter os níveis de ROS adequadas e proteger os seus constituintes contra dano oxidativo ^1,2. Superóxido dismutase (SOD) enzimas agem primeiro a convert superóxido a H ₂ O _2, que é posteriormente convertida em água pela catalase ou enzimas peroxidase. Estratégias de defesa não enzimáticas incluem principalmente moléculas que reagem mais rapidamente com ROS, em comparação com macromoléculas celulares, protegendo os componentes celulares essenciais. Apesar do papel protetor da ROS desintoxicação enzimas, algumas moléculas ROS escapar dos mecanismos de defesa antioxidante e levar a danos oxidativos. Detecção, reparação e degradação dos componentes celulares danificados são estratégias essenciais da defesa durante o estresse oxidativo ^1,2.

Vias de sinalização envolvidas na resistência ao estresse e estresse oxidativo especificamente são altamente evolutivamente conservada ^10,11. Ao contrário de experimentos de cultura de células, onde as condições organismal são apenas parcialmente reproduzido, o estudo do estresse oxidativo em organismos modelo ^12,13 tem um grande significado. C. elegans é um nematóide de vida livre que pode ser fácil e barata cultured em um gramado bacteriana no meio de ágar. É pequeno no tamanho (cerca de 1 mm de comprimento) e, normalmente, cresce como um hermafrodita auto-fertilizar, o que facilita as manipulações genéticas. Tem um ciclo de vida rápido e uma alta capacidade reprodutiva, produzindo cerca de 300 descendentes por geração, tornando-se uma ferramenta poderosa para executar telas genéticos de larga escala ^14. A C. elegans genoma está completamente sequenciado e 40-50% dos genes é previsível que sejam homólogos de genes associados a doenças humanas ^15-18. O knockdown de genes de interesse utilizando RNAi é rápida e fácil em C. elegans. Gene para baixo regulamento poderia ser alcançado através da alimentação de animais a E. bactérias coli que abrigam um plasmídeo que expressa o ARN de cadeia dupla que tem como alvo o mRNA de interesse ^19. Portanto, a determinação da função do gene usando telas de RNAi em grande escala tem um grande impacto na compreensão das doenças humanas, incluindo câncer ^20,21.

Estudos de Oresistência ao estresse xidative em C. elegans levaram à identificação de mecanismos conservadas de resistência ao stress oxidativo ^13,22. Algumas vias são identificadas vias comuns que modulam a longevidade e resistência a outros tipos de stress, bem como a hipóxia, calor, e stress osmótico. Estas vias incluem a sinalização de insulina, a sinalização TOR, e autofagia. Outras vias importantes envolvem desintoxicação de ROS como enzimas superóxido dismutase e enzimas catalase, ou na reparação de danos, tais como proteínas de choque térmico e acompanhar ^11,13,22.

Este protocolo descreve como para determinar a resistência ao stress oxidativo de C. elegans em líquido. Nós usamos flcn-1 (ok975) e animais de tipo selvagem para demonstrar o protocolo já que mostramos anteriormente um aumento da resistência ao estresse oxidativo após a perda de flcn-1 (ok975) em C. elegans ^23. Também mostraram que este aumento da resistência dependeem AMPK e autofagia, um eixo de sinalização que melhora bioenergética celular e promove a resistência ao estresse ^23. PQ é um estressor oxidativo que interfere com a cadeia de transporte de elétrons para produzir espécies reativas de oxigênio ^24. O mesmo ensaio pode ser adaptado e outras fontes de ROS ou compostos que geram ROS poderia ser utilizado tal como H ₂ O ₂ e rotenona. Ensaios semelhantes foram desenvolvidas em placas onde as baixas concentrações de PQ são utilizados ^25,26. A vantagem deste teste é que ele é muito rápido, e os resultados podem ser obtidos em apenas um dia. Além disso, o volume total de líquido utilizado para realizar o ensaio de resistência ao estresse oxidativo em placas de 96 poços é baixo quando comparado com o volume utilizado para preparar-PQ contendo placas. Portanto, a quantidade de PQ usado é no ensaio de líquido é baixa, o que torna o ensaio pouco dispendioso e limita a produção de resíduos tóxicos. No entanto, limitações deste ensaio em comparação com ensaios em placa incluem o lack de alimento no líquido de ensaio e a menor concentração de oxigénio no líquido, em comparação com o ar. Estes são factores importantes que, em alguns casos, podem influenciar os resultados. Portanto, confirmando a reprodutibilidade utilizando outros métodos de resistência ao estresse oxidativo é recomendado para suportar os resultados obtidos neste ensaio.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Preparação da mídia para C. crescimento elegans (neste caso, os animais selvagens e animais flcn-1 (ok975) mutantes).
   1. Prepare modificado apenas de Bacto-peptona (BOYM) mistura seca do Youngren contendo 5,5 g de Tris-HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl e 0,08 g de colesterol. Misture bem com agitação.
      NOTA: Esta mistura é suficiente para preparar 10 L de meio de MYOB.
      NOTA: placas normais meio de crescimento (NGM) poderia ser usado em vez de MYOB placas ^27. No entanto, o mesmo tipo de placas deve ser utilizada para comparações válidas entre estirpes e entre as repetições independentes. Neste protocolo, nós só usamos placas MYOB.
   2. Prepare 1 L de meio BOYM por adição de 6 g de BOYM mistura seca, 17 g de ágar e perfazer o volume de 1 litro com H ₂ O e autoclave durante 45 min a 122 ° C. Verter em placas e deixar secar à temperatura ambiente durante 2 dias.
   3. Utilizando uma técnica estéril, inocular 100 ml de culture de meio de caldo LB com E. bactérias coli OP50 e crescer O / N a 37 ° C.
   4. Placas MYOB semente com E. bactérias coli OP50. Deixe-a crescer à temperatura ambiente durante 48 horas.
2. Preparação para a regulação negativa do gene usando RNAi
   1. Prepare MYOB placas RNAi-alimentação. Proceder como em passos 1.1.1 e 1.1.2. Após autoclavagem, permitir que o meio arrefeça até cerca de 55 ° C e adiciona-se 1 ml de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 1 ml de 100 mM de ampicilina.
   2. Streak E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo RNAi flcn-1 específico em ampicilina (50 ug / mL) / tetraciclina (15 ug / ml) em placas de agar. Crescer a cultura O / N a 37 ° C.
   3. Escolha colônias e inocular E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo flcn-1 RNAi específico e crescer a cultura em LB / ampicilina (50 ug / ml) e meio O / N a 37 & #176; C.
   4. Placas de sementes com E. coli HT115 EV bactérias ou HT115 flcn-1 bactérias de ARNi.
      NOTA: Manter placas de 48 horas à temperatura ambiente antes do uso. Se RNAi knockdown por alimentação é eficaz em, utilizar outros métodos de entrega da ARN-DS ^28.
3. Induzir o estresse oxidativo utilizando paraquat (PQ):
   1. Preparar tampão M9 por mistura de 3 g de KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl e 0,25 g de MgSO ₄ 7 · _H2O Traga até 1 L com água destilada. Solução em autoclave durante 45 min a 122 ° C e armazenar garrafas à TA.
   2. No dia do ensaio, preparar a solução de M9 / PQ contendo. Para este protocolo, utilizar PQ 100 mM (0,1028 g de PQ dissolvido em 4 ml de tampão M9 preenche toda uma placas de 96 poços com 40 ul de M9 / PQ por poço).
      CUIDADO: PQ é um composto altamente tóxico e perigoso. Manusear de acordo com as orientações adequadas.
      NOTA: Quando a primeira a executar um novo scomboio ou de uma nova condição, recomenda-se a ensaio de sobrevivência em concentrações crescentes de PQ para determinar a melhor concentração de usar, a fim de matar os animais dentro de 7-10 horas.

2. Preparação de Age-sincronizado L4 População

1. Transferir 20 hermafroditas adultas grávidas a uma placa de MYOB fresco semeado com E. bactérias coli OP50. Prepare várias placas com base no número de vermes necessários durante o ensaio.
2. Permitir-lhes a pôr ovos durante 6 horas e em seguida, usando um worm fio de platina picareta remover as mães. Verificar as placas sob o microscópio para avaliar o número de ovos postos.
3. Permitir que os ovos para chocar e crescer a 20 ° C durante 48 h. Neste momento, os animais estão em um L4 / estágio final adulto jovem. Escolha mesmos animais de palco e transferir para os poços contendo a solução PQ.
   Observação: Uma vez que 48 horas de incubação só se aplica aos mutantes que crescem de forma semelhante aos animais de tipo selvagem, que é importante monitorizar de desenvolvimentotaxa de mutações recentemente testados para garantir que está de acordo com a taxa de desenvolvimento de tipo selvagem, de outra forma, outras linhas de tempo deve ser utilizado.
4. Alternativamente, a utilização de técnicas de sincronização. Gerar população sincronizada de vermes larvas L1 utilizando solução de hipoclorito (25 ml de água, 125 ml de hipoclorito de sódio a 5,25%, 50 ml de NaOH 4 M; embrulhar garrafa com folha de alumínio para isolar da luz). No entanto, para este ensaio, não é recomendável, uma vez que o branqueamento intenso pode afectar o comportamento dos animais durante o ensaio.
   CUIDADO: Manusear solução de hipoclorito de acordo com as diretrizes.
   NOTA: Ao usar o RNAi para regular para baixo o gene de interesse, sincronizar os hermafroditas, como descrito na seção 2, com excepção da transferência das mães para placas de RNAi semeados com as bactérias específicas de RNAi. Quando o knockdown com o RNAi é fraca, recomenda alimentação para várias gerações.

3. Realização do Estresse Oxidativo Resistência Ensaio

1. Pipetar 40 ml da solução de 100 mM de PQ (preparada) a cada poço de uma placa de 96 poços. Utilize pelo menos 12 poços com réplicas de todas as condições (tratamento, mutante, etc.). Usando um verme picareta fio de platina, transferir 5-8 animais larvas L4 para cada bem indicando o horário de início e fim do tempo.
2. Ao iniciar uma outra condição, anote o horário de início e fim do tempo. Colocar a placa a 20 ° C no tempo de incubação entre transferindo os vermes e marcando animais mortos uma hora mais tarde a partir da hora de início.
3. Utilizando o microscópio de dissecação, a contagem de sobrevivência a cada hora. Agite ligeiramente a placa antes de iniciar a contagem. Indique vermes que não se movem, mesmo após avistar uma luz de alta intensidade, como animais mortos. Além disso, indique o número de animais vivos.
   NOTA: Olhando forma verme, caudas e movimento da cabeça em alta ampliação, ajudar a determinar de vermes mortos vivos.
4. Repita este passo a cada hora até que a maioria dos worms estão mortos.

4. Determinação da Sobrevivência Percentagem em cada tempo de Ponto

1. Calcular o número total de animais por estado somando o número total de animais transferidas para cada poço. Ignore os animais que estão danificados ou mortos após a transferência.
2. Para cada ponto de tempo, calcular o número total de animais mortos por condição (soma de animais mortos nos 12 poços). Para cada ponto de tempo, calcular a percentagem de morte (número de animais mortos, dividido pelo número total de animais e multiplicado por 100) e percentagem de sobrevivência (100 menos a morte por cento).
3. Repetir este ensaio pelo menos três vezes independentes.

Resultados

Comparando-tipo selvagem C. elegans para flcn-1 (ok975) animais mutantes

Aqui utilizou-se 100 mM de PQ para determinar a resistência de tipo selvagem C. elegans animais em comparação com flcn-1 (ok975), que foi mostrado para resistir ao estresse oxidativo, calor e anoxia ^23. Após 4 h de tratamento, 48,3% da do tipo selvagem sobreviveram, em comparação com 77,8% de sobrevivência em-um (flcn ok975) animais. Como esperado, flcn-...

Discussão

C. elegans é um organismo modelo atractivo para estudar a resistência ao estresse oxidativo geneticamente in vivo, uma vez que podem ser facilmente cultivadas e rapidamente leva a um grande número de descendentes geneticamente idênticos. Vários métodos para medir a resistência de stress oxidativo têm sido anteriormente descrita e que se baseiam na suplementação de placas de cultura com várias fontes de ROS, como a PQ, rotenona, H ₂ O _2, e juglona ^25,26,29-32....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library