Mesurer le stress oxydatif Résistance<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En 96 plaques de microtitration bien

Résumé

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Résumé

Le stress oxydatif, qui est le résultat d'un déséquilibre entre la production et la détoxication des espèces réactives de l'oxygène, est un contributeur majeur à des troubles humaines chroniques, y compris les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, le diabète, le vieillissement et le cancer. Par conséquent, il est important d'étudier le stress oxydatif, non seulement dans des systèmes cellulaires, mais aussi en utilisant des organismes entiers. C. elegans est un organisme modèle attractif pour étudier la génétique de l'oxydation des voies de transduction de signaux de stress, qui sont hautement évolutives conservées.

Ici, nous fournissons un protocole pour mesurer la résistance au stress oxydatif dans C. elegans dans un liquide. Brièvement réactifs, ROS induisant tels que le paraquat (PQ) et H ₂ O ₂ sont dissous dans du tampon M9, et des solutions sont aliquotées dans les puits d'une plaque de microtitrage à 96 puits. L4 synchronisée / jeune adulte C. elegans animaux sont transférés dans les puits (5-8 animaux / puits) et on mesure la survietoutes les heures jusqu'à la plupart des vers sont morts. Lors de l'exécution d'un essai de résistance au stress oxydatif en utilisant une faible concentration de facteurs de stress dans les plaques, le vieillissement pourrait influencer le comportement des animaux sur le stress oxydatif, qui pourraient conduire à une interprétation erronée des données. Cependant, dans l'essai décrit ci-après, ce problème est peu probable étant donné que seules L4 / jeunes animaux adultes sont utilisés. En outre, ce protocole est peu coûteux et les résultats sont obtenus en une seule journée, ce qui rend cette technique attrayante pour les écrans génétiques. Dans l'ensemble, cela va aider à comprendre oxydatives voies de signalisation du stress de transduction, qui pourraient se traduire en une meilleure caractérisation des troubles d'oxydation humaines stress associé.

Introduction

Chez les eucaryotes, la phosphorylation oxydative de prendre place dans la chaîne de transport des électrons des mitochondries est le principal moteur de la production d'énergie sous forme d'ATP. Espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont un sous-produit naturel de ce processus. En dépit de leur rôle important en tant que molécules de signalisation, ROS excessive peut conduire à des lésions de l'ADN, des protéines carbonylation, et l'oxydation des lipides. Un déséquilibre entre la production de ROS et de désintoxication provoque le stress oxydatif, qui conduit à l'épuisement de l'énergie, des dommages cellulaires, et déclenche la mort cellulaire ^1,2. Le stress oxydatif contribue au vieillissement et au développement de nombreuses maladies mortelles telles que le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives ^3-9.

Les cellules ont développé des stratégies enzymatiques et non enzymatiques défense pour maintenir les niveaux de ROS approprié et pour protéger leurs électeurs contre les dommages oxydatifs ^1,2. La superoxyde dismutase (SOD) enzymes agissent premier à convert superoxyde de H ₂ O _2, qui est ensuite transformé en eau par la catalase ou peroxydase enzymes. Non stratégies de défense enzymatiques comprennent principalement des molécules qui réagissent rapidement avec ROS par rapport aux macromolécules cellulaires, protégeant les composants cellulaires essentiels. Malgré le rôle protecteur de ROS enzymes de détoxification, certaines molécules ROS échapper aux mécanismes de défense antioxydants et conduisent à des dommages oxydatifs. Détection, la réparation, et la dégradation des composants cellulaires endommagés sont les stratégies de défense essentielles pendant le stress oxydatif ^1,2.

Les voies de signalisation impliquées dans la résistance au stress et le stress oxydatif spécifiquement sont très évolutif conservée ^10,11. Contrairement à des expériences de culture de cellules où les conditions organismales ne sont que partiellement reproduit, l'étude du stress oxydatif dans des organismes modèles ^12,13 a une grande signification. C. elegans est un nématode vivant en liberté qui peut être facilement et économiquement culturés sur une pelouse bactérienne sur les médias agar. Il est de petite taille (environ 1 mm de longueur) et normalement se développe comme un hermaphrodite auto-fertilisation, ce qui facilite les manipulations génétiques. Il a un cycle de vie rapide et une forte capacité de reproduction, produisant environ 300 descendants par génération, ce qui en fait un outil puissant pour effectuer écrans génétiques à grande échelle ^14. Les C. elegans génome est entièrement séquencé et 40-50% des gènes sont prévu pour être homologues de gènes associés à des maladies humaines ^15-18. Le knock-down de gènes d'intérêt en utilisant l'ARNi est rapide et facile en C. elegans. Gene régulation vers le bas peut être obtenu par l'alimentation des animaux de E. colibacilles qui hébergent un plasmide exprimant l'ARN double brin qui cible l'ARNm d'intérêt ^19. Par conséquent, la détermination de la fonction des gènes en utilisant des écrans ARNi à grande échelle a un grand impact sur ​​la compréhension des maladies humaines, y compris le cancer ^20,21.

Les études de orésistance au stress xidative en C. elegans ont conduit à l'identification de mécanismes conservées de résistance au stress oxydatif ^13,22. Certaines filières identifiées sont des voies communes qui modulent la longévité et la résistance à d'autres contraintes ainsi comme l'hypoxie, la chaleur et le stress osmotique. Ces voies comprennent la signalisation de l'insuline, la signalisation TOR, et autophagie. Autres voies clés impliquent la détoxification des ROS tels que des enzymes superoxyde dismutase et de la catalase enzymes, ou la réparation des dommages tels que le choc de la chaleur et de protéines chaperonnes ^11,13,22.

Ce protocole décrit la façon de déterminer la résistance au stress oxydatif de C. elegans dans un liquide. Nous avons utilisé FLCN-1 (ok975) et les animaux de type sauvage pour démontrer le protocole puisque nous avons précédemment montré une résistance accrue au stress oxydatif sur la perte de FLCN-1 (ok975) en C. elegans ^23. Nous avons également montré que cette augmentation de la résistance dépendsur l'AMPK et de l'autophagie, un axe de signalisation qui améliore bioénergétique cellulaire et favorise la résistance au stress ^23. PQ est un facteur de stress oxydatif qui interfère avec la chaîne de transport d'électrons pour produire des espèces réactives de l'oxygène ^24. Le même dosage peut être adapté et d'autres sources de ROS ou des composés générant des ROS peut être utilisé tel que H ₂ O ₂ et la roténone. Des essais similaires ont été développées sur des plaques où de faibles concentrations de PQ sont utilisées ^25,26. L'avantage de ce test est qu'il est très rapide, et les résultats pourraient être obtenus en une seule journée. En outre, le volume total de liquide utilisé pour effectuer l'essai de résistance au stress oxydatif dans des plaques 96 puits est faible par rapport au volume utilisé pour préparer des plaques contenant PQ. Par conséquent, la quantité de la PQ est utilisé dans le dosage du liquide est faible, ce qui rend le test peu coûteux et limite la production de déchets toxiques. Toutefois, les limites de ce dosage par rapport à des essais de plaque comprennent la lack de la nourriture liquide dans le dosage et la plus faible concentration d'oxygène à l'état liquide par rapport à l'air. Ce sont des facteurs importants qui, dans certains cas, pourraient influencer les résultats. Par conséquent, confirmant reproductibilité en utilisant d'autres méthodes de résistance au stress oxydatif est recommandé de soutenir les résultats obtenus dans cet essai.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Préparation des médias pour C. la croissance elegans (dans ce cas, les animaux de type sauvage et les animaux FLCN-1 (ok975) mutantes).
   1. Préparez modification Seulement Bacto-peptone (MYOB) mélange sec de Youngren contenant 5,5 g de Tris HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl et 0,08 g de cholestérol. Mélangez bien avec agitation.
      NOTE: Ce mélange est suffisante pour préparer 10 L de milieu MYOB.
      REMARQUE: les plaques normales milieu de croissance (NGM) pourraient être utilisés à la place des plaques MYOB ^27. Cependant, le même type de plaques doit être utilisé pour des comparaisons valables entre les souches et entre les répétitions indépendantes. Dans ce protocole, nous avons seulement utilisé des plaques de MYOB.
   2. Préparer 1 L de milieu MYOB en ajoutant 6 g de MYOB mélange sec, 17 g d'agar-agar et porter à 1 L avec de H ₂ O et autoclave pendant 45 min à 122 ° C. Verser plaques et laisser sécher à température ambiante pendant 2 jours.
   3. En utilisant une technique stérile, inoculer 100 ml de culture de milieu de bouillon LB avec E. bactéries coli OP50 et poussent O / N à 37 ° C.
   4. Plaques semences MYOB avec E. bactéries coli OP50. Lui permettre de grandir à température ambiante pendant 48 h.
2. Préparation pour la régulation négative des gènes en utilisant l'ARNi
   1. Préparer MYOB plaques ARNi-alimentation. Procédez comme dans les étapes 1.1.1 et 1.1.2. Après autoclavage, laisser le milieu se refroidir à environ 55 ° C et ajouter 1 ml de 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 1 ml d'ampicilline 100 mM.
   2. Streak E. coli HT115 bactéries transformées avec un plasmide qui exprime soit de contrôle ou EV-1 FLCN ARNi spécifique à l'ampicilline (50 ug / ml de) / tétracycline (15 ug / ml) des plaques de gélose. Développer la culture O / N à 37 ° C.
   3. Prélever des colonies et l'inoculer E. coli HT115 bactéries transformées avec un plasmide qui exprime soit EV de contrôle ou FLCN-1 ARNi spécifique et grandissent dans la culture LB / ampicilline (50 ug / ml) à moyen et O / N à 37 & #176; C.
   4. plaques de semences avec E. coli HT115 HT115 bactéries ou EV-1 FLCN bactéries ARNi.
      REMARQUE: Conserver les plaques 48 heures à température ambiante avant l'utilisation. Si ARNi knockdown par l'alimentation est efficace, utiliser d'autres méthodes de livraison du ds-ARN ^28.
3. Induisant un stress oxydatif utilisant paraquat (PQ):
   1. Préparer du tampon M9 en mélangeant 3 g de KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl et 0,25 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O. Apportez jusqu'à 1 L avec de l'eau distillée. La solution en autoclave pendant 45 min à 122 ° C et de stocker des bouteilles à la température ambiante.
   2. Le jour du dosage, préparer la solution M9 / PQ contenant. Pour ce protocole, utilisez mM PQ 100 (0.1028 g de PQ dissous dans 4 ml de tampon M9 remplit toute une plaques à 96 puits avec 40 pi de M9 / PQ par puits).
      ATTENTION: PQ est un composé dangereux et très toxique. Poignée selon des directives appropriées.
      REMARQUE: Lors de l'exécution d'abord un nouveau strain ou une nouvelle condition, il est recommandé de doser la survie dans des concentrations croissantes de PQ afin de déterminer la meilleure concentration à utiliser dans le but de tuer des animaux dans les 7-10 h.

2. Préparation de l'âge de la population synchronisée L4

1. Transfert 20 hermaphrodites adultes gravides à une plaque de MYOB frais ensemencée avec E. bactéries coli OP50. Préparer plusieurs plaques sur la base du nombre de vers nécessaires au cours de l'essai.
2. Permettez-leur de pondre des œufs pendant 6 heures, puis en utilisant un ver fil de platine pointe, retirez les mères. Vérifiez les plaques au microscope pour évaluer le nombre d'œufs pondus.
3. Laisser les œufs éclosent et se développent à 20 ° C pendant 48 heures. A cette époque, les animaux sont dans un / stade jeune adulte fin L4. Choisissez mêmes animaux de scène et de transférer aux puits contenant de la solution-PQ.
   REMARQUE: Depuis 48 heures d'incubation applique uniquement aux mutants qui se développent de manière similaire aux animaux de type sauvage, il est important de contrôler le développementtaux de mutants nouvellement testés pour vous assurer qu'elle est conforme à la vitesse de développement de type sauvage, sinon, d'autres échéances doivent être utilisés.
4. Sinon, utilisez des techniques de synchronisation. Générer population synchronisée de L1 vers de larves en utilisant une solution d'hypochlorite (25 ml d'eau, 125 ml d'hypochlorite de sodium à 5,25%, 50 ml de NaOH 4; envelopper bouteille avec du papier d'aluminium pour isoler de la lumière). Cependant, pour cet essai, il est déconseillé, car le blanchiment intense peut affecter le comportement des animaux au cours de l'essai.
   ATTENTION: Manipuler solution d'hypochlorite selon les directives.
   REMARQUE: Lors de l'utilisation d'ARNi pour réguler à la baisse le gène d'intérêt, synchroniser les hermaphrodites comme décrit dans l'article 2, à l'exception du transfert des mères à plaques ARNi ensemencés avec des bactéries spécifiques ARNi. Lorsque l'effet de choc avec l'ARNi est faible, l'alimentation pour plusieurs générations est recommandé.

3. Effectuer le stress oxydatif Résistance Assay

1. Pipette 40 ul de la solution mM PQ 100 (préparé frais) à chaque puits d'une plaque de 96 puits. Utilisez au moins 12 puits comme réplique de chaque état ​​(traitement, mutant, etc.). Utiliser un ver choix de fil de platine, transférer 5-8 animaux de larves L4 à chaque puits indiquant l'heure de début et de la fin des temps.
2. Lors du démarrage d'une autre condition, noter l'heure de début et de la fin des temps. Placer la plaque à 20 ° C dans le temps d'incubation entre les transférer vers et marquant animaux morts une heure plus tard à partir de l'heure de début.
3. Utilisation de la loupe binoculaire, compter survie à chaque heure. Secouer doucement la plaque avant de commencer à compter. Indiquez les vers qui ne se déplacent pas, même après avoir repéré une lumière à haute intensité, comme des animaux morts. Veuillez également indiquer le nombre d'animaux vivants.
   NOTE: En regardant la forme de ver, queues et le mouvement de la tête à fort grossissement, aider à déterminer vers morts de vie.
4. Répétez cette étape toutes les heures jusqu'à la plupart des vers sont morts.

4. Détermination de la survie Pourcentage au point Every Time

1. Calculer le nombre total d'animaux par état en ajoutant le nombre total d'animaux transférés à chaque puits. Ignorer les animaux qui sont endommagés ou tués lors d'un transfert.
2. Pour chaque point de temps, calculer le nombre total d'animaux morts par condition (somme des animaux morts dans les 12 puits). Pour chaque point de temps, calculer le pourcentage de décès (nombre d'animaux morts divisé par le nombre total d'animaux et multiplié par 100) et le pourcentage de survie (100 pour cent moins décès).
3. Répétez ce test au moins 3 fois indépendants.

Résultats

De type sauvage comparant C. elegans à FLCN-1 (ok975) Les animaux mutants

Ici nous avons utilisé PQ 100 mM pour déterminer la résistance de type sauvage C. elegans animaux par rapport à FLCN-1 (ok975) qui a été montré pour résister au stress oxydatif, la chaleur, et l'anoxie ^23. Après 4 heures de traitement, 48,3% de type sauvage survécu par rapport à 77,8% de survie dans FLCN-1 (ok975) animaux. Comme prévu, FLCN-1 ...

Discussion

C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier la résistance au stress oxydatif in vivo génétiquement car il peut être facilement cultivées, rapidement et conduit à un grand nombre de descendance génétiquement identique. De multiples méthodes pour mesurer la résistance au stress oxydatif ont été précédemment décrit et ils sont basés sur la supplémentation des plaques de culture avec diverses sources telles que les ROS PQ, la roténone, H ₂ O _2, et jug...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library