一个算法的开发与高位脊髓损伤使用遥测装置进行自主神经异常反射的动物的综合研究

摘要

The catheter of a telemetry device is implanted into the abdominal aorta in order to continuously collect beat-by-beat hemodynamic data from animals pre and post-high thoracic spinal cord transection. A novel JAVA software was employed to analyze hemodynamic parameters as well as frequency and intensity of spontaneous episodes of autonomic dysreflexia.

摘要

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the mid-thoracic level can lead to a potentially life-threatening hypertensive condition called autonomic dysreflexia (AD) that is often triggered by noxious or non-noxious somatic or visceral stimuli below the level of injury. One of the most common triggers of AD is the distension of pelvic viscera, such as during bladder and bowel distension or evacuation. This protocol presents a novel pattern recognition algorithm developed for a JAVA platform software to study the fluctuations of cardiovascular parameters as well as the number, severity and duration of spontaneously occurring AD events. The software is able to apply a pattern recognition algorithm on hemodynamic data such as systolic blood pressure (SBP) and heart rate (HR) extracted from telemetry recordings of conscious and unrestrained animals before and after thoracic (T3) complete transection. With this software, hemodynamic parameters and episodes of AD are able to be detected and analyzed with minimal experimenter bias.

引言

自主神经异常反射（AD）是在颈部或高胸节急性或慢性脊髓损伤（SCI）后的个体威胁生命的紧急情况和通常的特征在于持续性高血压和心动过缓¹情节。 AD主要是由脊髓下行通道，通常要控制交感神经活性和血管张力^1-4脊髓交感神经节前神经元提供了从脊髓上输入中心的破坏引起的。高达300毫米汞柱的AD发作的特征在于收缩压（SBP）尖峰并且如果不治疗会导致癫痫发作，颅内出血，心肌梗塞，甚至死亡^5-8。各种有害和非伤害性刺激的作为AD的触发，包括肠和膀胱膨胀，痉挛，压疮，膀胱导尿或医源性程序^9-12。

AD的RESP的时间发展ONSE以SCI已经在人类⁹和动物模型^13,14了研究。通常这些研究已经使用了"诱导AD"的方法（ 即尿流动力学，在人类或动物的结直肠扩张阴茎vibrostimulations）确定AD的时间发展。这种方法由于需要在分离的时间点重复评估可能排除AD的时间发展的一个精确确定的限制。在人类中使用的24小时的血压监测器在预定的时间间隔进行串行血压测量。这种技术最近已用于监测慢性SCI自发产生的AD。在动物模型中，固态压力传感器正在越来越多地用于长期监控打逐击败动脉血压。近日，Rabchesvky 等 。 （2012），开发出了提取平均动脉压的二分之一的平均值的算法（MAP）的一个对一个移动平均阈值¹⁵相比Ð。基于MAP的峰是10毫米汞柱或更大的阈值以上的同时用10 BPM或更大的HR一滴自发公元事件进行了表征。

在这里，有一个建于公元检测算法一种新型的JAVA软件呈现。这个算法通过检测动脉血压（ABP）和心脏速率（HR），该指示一个自然发生​​的AD事件的预先确定的图案。用户能够手动调整所有输入变量的软件，使得'检测算法"可以容易地定制，以所关注的具体参数。该软件还能够二分法ABP和HR成一个给定的时期，使得血流动力学参数的昼夜节律可以分析^16。在本手稿，详细说明中给出，用于植入遥测设备和进行SCI手术手术技术。前还提供了相对于所述的AD检测软件的后处理能力和功能如何心血管amples被改变后的SCI。为了比较的目的，从被称为结直肠扩张诱导的AD的方法得到的方法和结果（CRD）也示出。

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研究方案

雄性Wistar（HSD:WI的Wistar）大鼠7周龄，体重300-350克本实验中使用。所有大鼠维持12小时的光/暗周期，并获得标准的实验室大鼠饲料和水随意。所有实验程序符合由加拿大议会关于动物饲养建立先导，以护理和使用实验动物，并授予伦理委员会批准由英国哥伦比亚大学。手术和动物护理是根据我们实验室的标准程序（拉姆齐等^，2010）17进行。

1.动物的制备:外科手术

1. 遥测装置植入
   注:协议被实施根据制造商说明和我们以前的与设备的注入经验^:16
   1. 与恩诺沙星预治疗的动物，一旦一个连续3天每天（10毫克/千克，S.C。）手术前。
   2. 在手术前从笼中取出固体食物9-13小时。在此期间可能会提供软食营养代餐。
   3. 麻醉用4％异氟烷在感应腔中诱导剂量和使用贝恩电路约1.5％异氟烷（1-1.5升/分钟氧气）的维持剂量的动物。用脚趾捏反射和角膜反射来评估动物是否是在麻醉手术平面。呼吸必须监测以评估是否麻醉深度太高（ 即 ，非常缓慢呼吸速率和喘息，苍白粘膜）或过低（ 即，快速，浅呼吸指示动物可能不会在麻醉的手术平面）。在手术期间和麻醉大约每5分钟的外科平面的重复监测调整异氟烷剂量是必要的。
      注:所有手术使用的无菌技术进行:具体而言，医生穿外科擦洗，帽，口罩和无菌手套。开配戴手套过程观察，高压灭菌含有手术器械使用无菌技术被打开手术组和动物开始手术之前叠加。手术工具是尖灭菌烫珠手术间（最多5次手术）。外科海绵和纱布使用前高压灭菌。在手术过程中，将动物保持在维持在37℃的循环水毯。
   4. 辖丁丙诺啡（0.02毫克/千克，SC）立即手术前。此外，管理酮洛芬（5毫克/千克; SC）手术前，以提供多峰镇痛。辖布比卡因（5毫克/公斤，SC）立即手术前，以提供本地线路块。在剃须腹部，应用交替氯己定和70％的乙醇拭子（各三次），接着碘伏为至少1分钟，并用70％的乙醇（具有新开醇每次擦拭）除去。皮肤的擦拭在同心的方式制成在切口线的中心开始并向外盘旋（以便不通过"回/来回"运动污染的区域）。用无菌纱布拭子和各个应用程序之间丢弃。此过程开始动物手术前重复三次。虽然修剪和手术擦洗，保持对异氟醚下约1.5％维持剂量连接到贝恩非再呼吸电路的鼻锥动物。以维持所需要的动物在麻醉的手术计划调整异氟烷水平。
   5. 做一个5厘米长的中线腹部切口，通过肌肉和腹膜露出肠子切割。
   6. 缩回肠（这将暴露在后腹壁降主动脉），盖上无菌手术纱布肠道用2-3的林格溶液毫升润湿并保持湿润与视需要，以防止组织脱水通过过程的其他林格。
   7. 钝解剖围绕主动脉和主动脉从利用虹膜铲刀的下腔静脉分离。
   8. 地方结扎（8-0丝缝合线）围绕主动脉的最外膜层，只是远端肾动脉的喙和尾部端。
   9. 解除结扎简要地阻塞血液流动，并在1-2毫米前的水平与一个25号针头弯曲在位于头90°髂分叉刺穿主动脉。
   10. 使用20号弯曲针引导遥测装置的导管的尖端进入主动脉。推进吻侧，以确保该针尖仅仅是远端肾动脉
       1. 利用组织粘合剂少量修复它。去除结扎并确保有由于导管或组织粘合剂无血流闭塞。
   11. 固定遥测装置的主体成使用4-0丝线缝合腹壁。使用4-0薇乔和4-0普理灵缝线关闭MUSC乐和皮肤，分别。
2. 遥测植入手术后护理
   注意:对于前14天手术后的动物应每天至少3次检查中，除了一个详细监测评估每天一次。评估动物在7类:体重，体貌（疼痛是基于迹象，如增加眼睛，鼻子和前爪周围看到卟啉生产和面部鬼脸体征评估），行为/活动，排便，皮肤（包括中恒，立毛，切口愈合不良及皮下积液），水化和呼吸。
   1. 喂动物，水果，谷物品种，软食营养代餐，并提供水自由采食，遥测装置植入后6天。动物应该有扣缴第一天操作后定期固体啮齿动物饲料。注入动物温热乳酸林格溶液（5毫升）皮下第3天手术后，经外观脱水的症状。管理在早上和晚上检查（皮肤帐篷苍白耳/粘膜的迹象）林格溶液（5毫升）在必要时对动物进行评估。
   2. 辖恩诺沙星（10毫克/千克，SC）和酮洛芬（5毫克/公斤，SC），每天一次，连续3天手术后。手术后的以下3天早晚（ 即，每12小时）期间管理丁丙诺啡（0.02毫克/公斤，SC）。如果疼痛/窘迫的迹象都指出丁丙诺啡中旬的一天剂量（0.02毫克/千克，SC）可施用。
3. 脊髓全横断
   注:让动物从遥测植入手术T3完全离断术前恢复至少14天。
   1. 预对待动物的预防性恩诺沙星（10毫克/公斤，SC）为SCI手术前三天。
   2. 如前所述麻醉4％异氟烷的诱导剂量下的动物。进一步，用注射盐酸氯胺酮（70毫克/千克，IP）和盐酸右美托咪（0.5毫克/千克，IP）的动物。
      注意:对于完全离断手术，造成异氟醚血管扩张往往呈现止血的问题，一旦线切断。可以通过使用氯胺酮/右美托咪鸡尾酒来防止这个问题。动物应麻醉20-25分钟，并使用脊髓横断手术以下阿替美唑（1毫克/千克，SC）逆转。
   3. 手术前施用皮下丁丙诺啡（0.02毫克/千克），和酮洛芬（5毫克/千克）。辖布比卡因（5毫克/公斤，SC）立即手术前，以提供本地线路块。在剃须腹部，交替氯己定和70％乙醇的刷子（各三次），接着碘伏应适用于至少1分钟，并用70％的乙醇（具有新开醇每次擦拭）中除去。刷子在同心的方式作出开始在切口线的中心，并且向外盘旋（以便不通过"回/来回"运动污染的区域）。用无菌纱布和各个应用程序之间丢弃。开始动物手术前重复该过程三次。虽然修剪和手术擦洗，保持动物的鼻锥下异氟醚的约1.5％，维持剂量（按要求调整，以保持麻醉手术平面）。在整个手术动物的持续时间被保持在保持在37℃的循环水毯。
   4. 做一个背中线切口，2厘米长，在浅肌层覆C8-T3椎体。
   5. 布朗特以揭示硬脑膜层解剖。
   6. 刺穿与microscissors或用25号针头的尖端硬脑膜层。
   7. 打开在T2-T3椎间隙硬脑膜和使用microscissors执行完全横断。打开microscissors但不足够的横向破裂椎arterieS和静脉。在迅速的运动横切脊髓和搜索在动物后肢夸张的抽搐。确认通过喙和尾部脊髓树桩目视间隔完全横断。
   8. 确认后，将树桩之间明胶海绵，以达到止血。施加足够的明胶海绵止血和脊髓的树桩分开。
   9. 使用4-0薇乔和4-0普理灵缝线关闭肌肉和皮肤，分别为。脊髓损伤手术后，给动物预温热乳酸林格氏溶液（5毫升，SC 30℃），并允许它们在温度受控的环境中恢复。
4. 脊髓横断术后护理
   注意:对于前14天手术后的动物应每天3次检查中，除了每天一次一个详细的监测评估。 14天后详细的监测评估可能隔日重复。评估动物在7 catego里斯:体重，体貌（疼痛是基于迹象，如卟啉和面部鬼脸评估），行为/活动，排便，皮肤（包括中恒，竖毛，切口愈合不良及皮下积液），水化和呼吸。用于第一5-7天气囊应该检查并表示每天至少3次。
   1. 喂动物，水果，谷物品种，营养软食代餐，并提供水自由采食，脊髓横断手术后8-14天。注入用温热乳酸林格氏溶液（5毫升）皮下注射动物手术后的第3天，在脱水症状。管理的检查过程中林格溶液（5毫升）在必要时对动物进行评估。
      注:脊髓横断后，大鼠表现出后肢瘫痪，并采用屈曲和前肢，这是在这个损伤模型保存扩展走动。老鼠缺乏躯干和尾巴支持。为了方便它们在笼子里的运动，橡胶格应置于下滚燕麦床上用品。这使得大鼠与前爪抓住网格，并在笼子容易移动到获取食物和水。床上用品应每天更换。在脊髓横断后第7天，燕麦床上用品应该由它们原来的木片床上用品所取代。因为给大鼠丁丙诺啡燕麦卷被褥使用可以开发PICA在他们吃的床上用品，这可能会导致食管impactions。燕麦与燕麦食管吸湿嵌塞尚未观察到。
   2. 辖恩诺沙星（10毫克/千克，SC）和酮洛芬（5毫克/公斤，SC）每天一次连续3天手术后。手术后的以下3天早晚（ 即 ，每12小时）期间管理丁丙诺啡（0.02毫克/公斤，SC）。如果疼痛/窘迫的迹象都指出丁丙诺啡中旬的一天剂量可以。

2.遥测血流参数监测

1. 收集每天打逐拍动脉血压（ABP）和核心体温24小时，预先和后SCI。采样动脉血压和核心体温在使用遥测装置24小时的块1000赫兹。
2. 放置的SmartPad下动物笼换能器的无线再充电，并用于接收来自换能器的数字遥测信号。
   注意:输出电压随后被传递到连接到计算机，该组织从每个通道的数据流的配置。该电压被转换为连续的动脉血压和温度记录。可视利用数据采集软件的采样数据，如LabChart。
3. 丢弃动物监测过程中收集的遥测数据，以及在10分钟之前立即监测和监测10分钟后。

3.自发INCID评估自主神经异常反射的分配办法（AD）

注:频率，严重程度，和自发的广告事件的持续时间是用我们自己的小说AD检测 JAVA平台软件（ 图4）开发了一种算法评估。新算法已经发展到自动根据之前和SCI利用图2指定的参数后24小时SBP和HR遥测录音自发的广告事件。

1. 在提取使用采集软件的计息期限从原材料遥测数据SBP和HR值。
   注意:采集软件检测并确定从连续ABP录音SBP峰的值。心脏速率是通过确定相邻收缩压峰之间的时间距离外推。
2. 上传遥测录音在A列interbeat区间，在B列SBP值，列C MAP值和时间的CSV文件我N个列D（图4A）。
3. 使用软件（图4B-D），指定相关生理HR范围（即 R到R的间隔）180 BPM和625 BPM之间的SBP录音。指定下心率和最小 心率最大面板的软件中的相关人力资源范围。
4. 通过240秒的移动平均窗口中创建了SBP和HR的阈值。表明移动平均阈值在广告持续时间阈值面板上的分析窗口长度。
5. 在20毫米汞柱均线基线上方设置一个SBP换位门槛。表明，在移动平均阈值换位BP面板换位值。
6. 隔离收缩压峰簇超出换位阈用峰 - 峰间隔少于2秒和大于10秒的持续时间。指定峰使用峰间间隔BP和杜峰间隔使用峰丛间隔BP面板比间隔。
7. 组收缩压峰簇是彼此的120秒内。
   注意:在彼此的120秒内检测到的电位的AD事件将被分组为单个事件。指定连续SBP集群之间可以区分的广告持续时间阈值面板独立的广告事件的最长持续时间。
8. 确认是否收缩压峰簇群通过检测在40 BPM或更大的人​​力资源的下降与潜在自发的AD事件相关联。
   1. 在潜在事件的发病人力资源值的平均值的10％（指定要在上心脏速率这个百分比下降平均范围面板）。从电势事件结束的心脏速率值的平均值的75％（指定要在下部这个百分比心脏率下降平均范围面板）。
   2. 减去从较高心脏速率阈下心脏速率的阈值，以确保一个correspon40 BPM或更大的下降鼎。使用指定的心脏率下降限制面板的心脏率下降限制。
9. 一旦面板已经排满，按确定 。检测出的AD事件的图形表示呈现，包括收缩压的尖峰和相关联的人力资源数据（ 图4C-D）。一个输出excel文件也与升压反应（毫米汞柱），持续时间（秒），最大值收缩压（毫米汞柱），最小的HR（BPM），每个检测出的AD事件的心率下降（BPM）中产生。

4.结直肠扩张有意引导学生AD

注:AD诱发的严重程度可以通过结直肠扩张（CRD），模仿肠例行^3,18,19临床相关的刺激来确定。

1. 验证弗伦奇导管的囊（直的，10法语，将3ml 35厘米，游离胶乳）不被用2ml空气充气它泄漏。
2. 第约束通过包裹在毛巾，让血压和心率稳定了半个小时ê动物。
3. 放置润滑剂在导管的尖端。放置一个标记在导管用永久性标记，2厘米从气囊的中间。导管经由肛门插入结肠插入直到标记在开口刚刚可见。固定导管与外科胶带的尾部。重新放置在他的家笼中的动物包裹放在接收器匹配的SmartPad在动物体内植入的传感器。允许动物的血压正常化10分钟。
4. 导管的插入和相关的适应期（ 即，10分钟）后，注入2毫升的空气的气球在10秒内，使血压和心率稳定。保持扩张1分钟。确保在导管的尖端保持在直肠内。重要的是不要过度膨胀球囊（ 即，将 3ml +），以避免对结肠的破裂。
   注意:腹胀为1分钟的持续时间与＃160;允许升压反应的发展和与AD的感应情节相关联的压力感受器介导的HR降适当的时间。此外，此1分钟内还提供了足够的时间，心血管指数的正常化。
5. 重复扩张每次​​试验的3倍，试验间10分钟的最小间隔每日重复试验。一旦评估完成，从动物取出导尿管。
6. 平均节拍由拍数据超过1秒的间隔和报告SBP在多个试验最高涨幅和最大跌幅人力资源。

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结果

使用遥测技术，动脉血压是在1000赫兹的频率连续24小时取样。使用LabChart动脉血压（ABP）的说明性记录示于图1B。样品ABP被插入降主动脉固态压力传感器监测。小说JAVA平台AD检测软件能够提取相关收缩压（毫米汞柱）峰（ 图1C）。我们还可以提取来自相邻SBP峰（ 图1D）之间的时间间隔的心率（BPM）。

SBP和HR通过在1000赫兹采样节拍ABP从节拍...

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讨论

该协议描述了详细的实施这将与一个遥测装置相结合，在SCI-动物（ 图1B）ABP的长期深入分析的新的JAVA平台的AD检测软件。这是第一个软件，它允许为ABP图案表征，因为它们偶尔发生在一天的持续时间，以检测自发广告事件。充分表征T3 SCI动物模型可以说明检测自发AD的频率，升压反应和持续的软件功能的能力。随着检测自发广告事件，该软件可以分析ABP振荡和辨别血流动力学参数的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 Male Wistar Rats -Hsd-WI (250-300g)	Envigo (formerly Harlan Laboratories)	141
Lab Chart (PowerLab® Data Acquisition System)	AD Instruments
Pressure Telemeter	Millar Inc.	RP-TRM54P
Configurator	Millar Inc.	TR190
SmartPad	Millar Inc.	TR180
Isoflurane (Aerrane)	Baxter Corp.	DIN: 02225875
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Healthcare	DIN: 02169428
5-0 Silk Sutures	Ethicon	S182
4-0 Vicryl Subcuticular	Ethicon	J496G
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN: 0281250
Bupivicaine Hydrochloride (Marcaine 0.5%)	Hospira Healthcare Corp.	DIN: 02305909
Ketoprofen (Anafen)	Merial	DIN: 02150999
Ketamine Hydrochloride (Vetalar)	Bioniche	DIN: 01989529
Dexmedetomidine Hydrochloride (Domitor)	Pfizer	DIN: 02333929
Lactated Ringer's Solution	Braun Medical Inc.	DIN: 01931636
Gelfoam #12	Pharmacia & Upjohn Company	03603-14-1
Microscissors	Fine Science Tools	15003-008
Iris Spatulae	Fine Science Tools	10094-13
10 French 35 cm Foley Catheter	Coloplast	AA6110
Dietgel®	Clear H2O, Westbrook, ME	76A
LabDiet Rodent Diet 5001	Purina Mills (PMI®)	5001
Chlorhexadine (Hibitane)	Wyeth Animal Health, Guelph, Ontario	DIN 00245097
Atipamezole Hydrochloride(Antisedan)	Orion Pharma	DIN: 02237744