铁磁金属裸支架对血管内皮细胞捕获和保留

摘要

我们的目标是设计，制造和测试铁支架内皮细胞捕获。十支架进行了测试骨折10多个支架进行了测试保留磁性。最后，10支架体外测试和8个支架植入4头显示细胞捕获和保留。

摘要

心血管支架的快速内皮化是必要的，以减少支架血栓，并避免抗血小板疗法可减少出血的危险。利用磁力来捕捉和保留标记与超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）内皮细胞生长（EOC）的可行性先前已经证明。但该技术需要一个机械官能支架由磁性和生物相容性材料随后在体外和体内试验证明快速内皮化的发展。我们开发了从2205双相不锈钢弱磁性支架采用计算机辅助设计（CAD）和它的设计采用有限元分析（FEA）进一步完善。支架的最终设计在机械卷边和扩张呈现下面的材料的断裂极限一个主应变。一百支架被制造和它们的子集被用于机械测试，保留ained磁场测量，体外细胞捕获的研究，并在体内植入研究。十支架进行了测试部署，以验证他们是否持续的压接和膨胀循环无故障。另有10支架均采用强大的钕磁磁化，其保留的磁场进行了测量。该支架表明，该保留的磁性足以捕捉SPION标记的EOC 在我国的体外研究 。 SPION标记EOC采集和保留的大动物模型通过植入1磁化支架和各4头1个非磁化控制支架进行了验证。 7天后的支架的动脉植和组织学分析。在这项研究中开发的弱磁性支架有能力吸引和留住SPION标记的内皮细胞可促进快速愈合。

引言

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

研究方案

所有的动物研究批准的机构动物护理和利用委员会（IACUC）在梅奥诊所。

1.设计一个2205不锈钢支架与分析

1. 设计采用CAD裸金属支架
   1. 通过选择与墙壁的厚度等于支架支撑厚度'挤压凸台/基"功能生成拉伸中空的圆柱体。
   2. 设计在不同的草图平面切向挤压筒支架模式。使的平面图案的宽度在挤压空心圆柱体的圆周匹配。
   3. 传送平面图案设计到使用换行功能的中空圆柱体。
   4. 保存零件在其原生格式，并在ACIS格式导出的有限元分析。
2. 对于支架模型的有限元分析
   1. 导入保存格式ACIS立体几何到有限元分析软件进一步analys的部分模块是。
   2. 同轴2建模分析气缸在有限元分析软件的一部分建模的支架。外筒具有比所述支架的直径大的初始直径来模拟夹紧器和内筒具有1毫米的最初直径，以模拟一个气球充气。
   3. 双击组件建模的"实例"树项组装上面说的部件的相对位置。
   4. 使用有限元分析软件的网模块，指定元素类型为20节点六面体元素缩减积分，指定的元素大小，和网格支架。
   5. 指定的支架，并分别在模型树的"互动性"的两个气缸之间的摩擦刚性接触对。
   6. 指定的2205不锈钢弹塑性应力应变行为的支架模型​​。
   7. 限定边界条件至外部气缸首先卷曲到1毫米它模拟的Crimping支架。除去外筒，以模拟卷曲支架的松弛。扩大内筒至3毫米，以模拟膨胀，最后，取出内筒以模拟支架的反冲。
   8. 定义仿真参数，包括处理器和RAM容量的分配在"分析"模型树项目的数量和运行模拟。
   9. 一旦仿真完成后，打开结果文件（filename.odb）和后处理的结果，研究了主应变和迭代地提高支架设计，达到了20％的主应变小于该材料的失效极限。

2.支架制造工艺和检验压着扩建

1. 支架制造
   1. 获取2205不锈钢管通过深钻孔和精密研磨棒料的材料在精密加工公司，如操作精密产品的先锋，OH。
   2. 转移精密研磨管和平板型式的支架设计，支架切割公司，如Laserage技术公司在沃基根，IL激光切割和电抛光。
   3. 通过浸没在他们10分钟，然后用碱（10％的NaHCO _3）再过10分钟强酸（50％HCl）的钝化电抛光支架的表面上。小心:处理与适当的防护设备和在通风橱的化学物质。最后，洗净用乙醇和去离子水的支架。这个过程被称为酸洗。
2. 制造支架的卷边和扩展测试
   1. 压支架使用上保持压接工具手一个三折的气球。握住支架和压接工具的三折气球。按下手柄径向变形支架上的气球被卷曲。
   2. 检查用显微镜均匀卷曲和失败的在适当的结构中的任何迹象的卷曲支架塑性变形。
   3. 通过加压三折气球水其扩大到3毫米的设计直径。检查扩展支架的微观骨折和均匀膨胀。

支架的保留磁场3.表征

注:直径为2英寸和1英寸高度的圆柱磁体被用于本研究。磁体的磁极沿轴线对齐。磁体的表面磁通量密度为约1 T.

1. 磁化支架径向或轴向使用强钕磁铁。握住支架靠近强磁铁的磁化大约1分钟。
2. 持在平坦面中的一个的支架，其直径沿着磁场线被径向磁化或保持旁边圆柱形表面的支架，其沿着磁力线轴线轴向磁化它。保留磁FIELD中的支架被发现是稳定至少24小时，但磁化后尽快使用支架。
3. 单独安装支架到玻璃心轴，然后装入玻璃心轴的磁探测夹具的精度夹头。磁性微传感器探头可以精确地定位靠近所述支架而不触及使用XYZ表级的磁性探测夹具的装配表面（图4）。
4. 测量磁性微传感器的基线读数远离支架，然后通过定位使用磁探测夹具的XYZ阶段探针测量保留磁场在支架的表面。

4.磁性细胞捕获研究

1. 获得的细胞，具有SPION和染色用荧光染料标记
   1. 在^5,7描述来源于猪外周血内皮生长细胞（EOC）。培养在T-75烧瓶unti升大约80％铺满（5×10 ⁶至8×10 ^6个细胞 ）。
   2. 合成SPIONs如10纳米直径磁铁矿_铁 （Fe 3 _O 4）芯如^8,9-描述的50纳米厚的聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）壳包围。
   3. 孵育衍生EOC与SPION以200微克/毫升细胞培养基的16小时的浓度在^37℃。
   4. 轻轻吸出细胞培养基。轻轻加入10ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）的至烧瓶，摇摆，并且吸取PBS洗涤细胞。
   5. 将细胞染色用荧光染料（CM-DII）为在实验过程中可视化。这是根据制造商的说明，通过以5微升/毫升的浓度将染料加入至10ml细胞培养基并与细胞在37℃温育30分钟进行。
   6. 清洗细胞，用PBS作为步骤4.1.4并用3毫升的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液中5分钟，在37℃至解除从烧瓶的细胞。
   7. 用PBS细胞悬液转移到15毫升锥形管，顶部关闭，离心机在500×g离心5分钟，以形成细胞片状沉淀。
   8. 重悬在PBS中的细胞沉淀在1-2x10 ^6细胞 / ml的浓度和在进出锥形管的几次通过移液彻底混合。
2. 在体外细胞研究
   1. 设计和制造（例如，3D打印）一个简单的夹具保持支架只是玻璃盖玻片的表面上方。
   2. 使用电磁消磁器消磁支架或磁化支架径向或轴向使用强钕磁铁。
   3. 移液器SPION标记EOC悬浮在PBS到包含轴向磁化或径向磁化或非磁化控制支架的菜。图像使用倒置荧光显微镜与EOC立即用于荧光悬浮在PBS中的支架。

5。 在体动物研究

1. 支架植入术
   1. 绘制外周血4健康约克夏猪-体重约50 KG -分别在^5,7描述的前3周支架植入和文化EOC。
   2. 辖抗血小板药物治疗（每日服用阿司匹林325毫克和氯吡格雷75毫克）开始前3天手术。
   3. 在支架植入术当天，麻醉猪肌肉注射Telazol，甲苯噻嗪和阿托品（5 / 2-3 / 0.05毫克/千克分别）在适用的机构动物护理和使用规范中规定的。
   4. 插管，并将猪的吸入1-2.5％异氟醚麻醉。
   5. 剃猪的腹的颈部区域，并进行中的过程一般在无菌条件。
   6. 植入物1磁化和1未磁化的支架成使用标准的心导管术的右冠状动脉（RCA）。
      1. Cathete动物化应该由经过培训的介入性心脏病进行。访问右颈动脉用一个9法国鞘。
      2. 导管插入目标冠状动脉注入碘造影剂，以获得透视图像。
      3. 发生在动脉中的0.014英寸标准冠状动脉导丝。推进气囊及支架使用该导丝和部署在3-3.5毫米直径的血管支架。
   7. 闭塞的RCA近端内的血流使用具有线上气囊植入支架和递送约2×10 ⁶的自体的EOC标记SPION通过中央导管悬浮在4毫升PBS中在2分钟内。
   8. 附加闭塞2分钟后恢复血流的RCA。
   9. 动物转移到康复室，并密切监测动物，直到它恢复意识。
   10. 继续给予抗血小板药物（阿司匹林325毫克和氯吡格雷75米g）发布操作，直至牺牲。
2. 支架外植体和组织学
   1. 安乐死动物手术后7天通过首先麻醉动物如前所述，然后施用静脉内致死剂量的戊巴比妥钠（100毫克/千克）按照适用的机构动物护理和使用指南。
   2. 手术收获了支架的动脉段。固定在10％福尔马林缓冲液中取出的动脉最少30分钟。留在福尔马林缓冲的样本进行进一步的组织学分析。
   3. 外包固定样本能够与金属支架进行组织学的设施。在处理过程中，样本被嵌入甲基丙烯酸甲酯，横截面，并分析了组织学上使用Mallory的染色技术与普鲁士蓝染色为铁粒子。

结果

根据有限元分析（图1）的迭代支架设计显示的支架，可以压接并扩大与20％的主应变小于30％的极限应变。卷边和膨胀试验（ 图2）显示骨折的迹象。图片变形支架均与有限元分析计算出变形较好的一致性，也显微图像，显示没有骨折（ 图3）。正如预期的那样，从被保持磁场的测量（ 图4和5），SPION标记的细胞是在轴向磁化的支架优选地吸引...

讨论

我们开发了一种磁性支架可以用作裸金属支架，能够吸引SPION标记的内皮细胞。在涉及磁支架先前的研究中，研究人员已经使用由磁性材料制成的镍涂覆的商业支架和线圈或网格，由于强磁性支架^5,10-14的不可用性。其它基团也用于靶向纳米颗粒加载内皮细胞³市售304级不锈钢支架的顺磁性性质。镍涂层可以是过敏于接收到所述支架的患者和所述顺磁性支架需要的外部磁场，以吸引?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation		Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems		Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00003568
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon			Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems		Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions		Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic		Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian