Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

Zusammenfassung

Unser Ziel war es, entwickeln, produzieren und testen ferro Stents für Endothelzellen-Capture. Zehn Stents wurden zur Fraktur getestet und 10 weitere Stents wurden für einbehaltene Magnetismus getestet. Schließlich wurden 10 Stents in vitro getestet und 8 weitere Stents wurden in 4 Schweinen implantiert, um die Zellaufnahme und Retention zu zeigen.

Zusammenfassung

Schnelle Endothelialisierung kardiovaskuläre Stents erforderlich ist, um Stent-Thrombose zu verringern und die Anti-Thrombozyten-Therapie, die das Blutungsrisiko zu verringern, zu vermeiden. Die Durchführbarkeit der Verwendung von magnetischen Kräfte zu erfassen und behalten endothelialen Zellen Auswuchs (EOC) mit Super-paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) markiert wurde zuvor gezeigt. Aber diese Technik erfordert die Entwicklung eines mechanisch funktionale Stent aus einem magnetischen und biokompatiblen Material, gefolgt von in-vitro und in-vivo-Tests, um eine schnelle Endothelisierung zu beweisen. Wir entwickelten ein schwach ferromagnetischen Stent aus 2205 Duplex-Edelstahl mit Computer Aided Design (CAD) und sein Design wurde weiter unter Verwendung von Finite-Elemente-Analyse (FEA) verfeinert. Das endgültige Design des Stents zeigten eine Hauptdehnung unterhalb der Bruchgrenze des Materials bei der mechanischen Crimpen und Expansion. Einhundert Stents wurden hergestellt und eine Teilmenge davon wurde für die mechanische Prüfung, ret verwendetained Magnetfeldmessungen, in-vitro Zelleinfang Studien und in-vivo-Implantation Studien. Zehn Stents wurden für den Einsatz getestet, um zu überprüfen, ob sie anhalt Crimpen und Expansionszyklus ohne Ausfall. Weitere 10 Stents wurden unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten magnetisiert und ihre beibehalten Magnetfeld gemessen. Die Stents zeigten, dass die zurückgehalten Magnetismus war ausreichend, um SPION-markierten EOC in unserer In-vitro-Studien zu erfassen. SPION-markierten EOC-Abscheidung und Retention wurde in Großtiermodellen durch Implantation von 1 magnetisierten Stent und 1 nicht-magnetisierten Kontrollstent in jedem der 4 Schweinen nachgewiesen. Stent versehenen Arterien wurden nach 7 Tagen explantiert und histologisch ausgewertet. Die in dieser Studie entwickelt schwach magnetischen Stents waren in der Lage, die Gewinnung und Bindung SPION-markierten Endothelzellen, die schnelle Heilung fördern können.

Einleitung

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Studien wurden von der Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) an der Mayo Klinik genehmigt.

1. Entwurf und Analyse von einem 2205 Edelstahl-Stent

1. Entwerfen einer Bare-Metal-Stent unter Verwendung von CAD-
   1. Stellen Sie eine extrudierte Hohlzylinder, indem Sie auf 'extrudierten Chef / base "-Funktion mit der Wanddicke gleich der Stentstrebendicke.
   2. Entwerfen Sie ein Stentmuster auf einer anderen Skizze Ebene, die den Strangpresszylinder. Stellen Sie die Breite der flachen Muster, um den Umfang des extrudierten Hohlzylinder entsprechen.
   3. Übertragen Sie das flache Design-Muster auf den Hohlzylinder mit dem Wrap-Funktion.
   4. Speichern Sie das Teil in ihrem nativen Format sowie in ACIS Format für FEA exportiert werden.
2. Finite-Elemente-Analyse für die Stent-Modelle
   1. Importieren Sie die Volumengeometrie in ACIS-Format gespeichert in den Teil-Modul des FEA-Software für weitere Analytikist.
   2. Modell 2 analytischen Zylinder koaxial mit dem Stent in dem Teil-Modellierer des FEA-Software. Der äußere Zylinder hat einen Anfangsdurchmesser größer als der Durchmesser des Stents der Kreppvorrichtung zu simulieren, und der innere Zylinder weist einen Anfangsdurchmesser von 1 mm, um einen Ballon zum Aufblasen simulieren.
   3. Doppelklicken Sie auf das Strukturelement der Baugruppe Modeler 'Fälle', um die oben genannten Teile zusammenzubauen in relativen Positionen.
   4. Verwenden Sie die Mesh-Modul des FEA-Software, geben Sie den Elementtyp als 20 Knoten Hexaeder-Element mit reduzierten Integration, geben Sie die Elementgröße und Netz den Stent.
   5. Geben reibungs starren Kontaktpaare zwischen dem Stent und der beiden Zylinder jeweils in den "Interaktionseigenschaften" der Modellbaum.
   6. Weisen Sie elasto-plastische Spannungs-Dehnungs-Verhalten von 2205 aus Edelstahl mit dem Stent-Modell.
   7. Randbedingungen zu definieren, um den Außenzylinder bis 1 mm, die den c simuliert zunächst CrimpRimping des Stents. Entfernen des äußeren Zylinders, um die Entspannung des gequetschten Stents simulieren. Erweitern Sie den inneren Zylinder bis 3 mm auf Expansion zu simulieren und schließlich, entfernen Sie den inneren Zylinder, um Rückstoß des Stents zu simulieren.
   8. Definieren Sie die Simulationsparameter einschließlich der Anzahl der Prozessoren und Größe des Arbeitsspeichers im "Analysis" Modellbaum Posten zugeordnet und führen Sie die Simulation.
   9. Sobald die Simulation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ergebnisdatei (filename.odb) und Post-Prozess die Ergebnisse an den Hauptdehnungen studieren und iterativ zu verbessern, den Stent-Design, um eine Hauptdehnung von 20%, der kleiner ist als der Ausfallgrenze des Materials zu erreichen .

2. Stent Herstellung und Testing für Press- und Expansion

1. Stent Herstellungs
   1. Besorgen Sie sich die 2205 Edelstahlrohre von gun Bohren und Präzisionsschleifen Stangenmaterial bei einer Präzisionsbearbeitung Unternehmen wie Aktions Precision Products in Pioneer,OH.
   2. Übertragen Sie die präzisionsgeschliffen Röhren und die Abwicklung Stent-Design auf einen Stent Schneid Unternehmen wie Laserage Technology Corporation in Waukegan, IL zum Laserschneiden und Elektropolieren.
   3. Passivieren der Oberfläche der elektro Stents durch Eintauchen davon in einer starken Säure (50% HCl) 10 min lang, gefolgt von einer Basis (10% _NaHCO 3) für weitere 10 min. VORSICHT: Gehen Sie mit Chemikalien geeignete Schutzausrüstung und unter einer Abzugshaube. Schließlich, waschen Sie die Stents mit Ethylalkohol und entionisiertem Wasser. Dieser Vorgang wird als Säurebeizen.
2. Testen von hergestellten Stent zum Crimpen und Expansion
   1. Crimp den Stent auf eine dreifach gefaltete Ballons mit einem Handpresswerkzeug. Halten Sie den Stent und den Dreifach-Ballon in die Crimp-Werkzeug. Drücken Sie den Griff, um radial zu verformen, um den Stent auf dem Ballon gequetscht werden.
   2. Untersuchen Sie den gecrimpten Stent unter Verwendung eines Mikroskops für eine gleichmäßige Kräuselung und keine Anzeichen einer Störung in der Struktur aufgrundim plastischen Bereich.
   3. Erweitern Sie es an die entworfen Durchmesser von 3 mm durch Unterdrucksetzen des trifold Ballon mit Wasser. Untersuchen Sie die erweiterten Stents für die mikroskopische Brüche und gleichmäßige Expansion.

3. Charakterisierung der Stent für Rück Magnetic Field

HINWEIS: Zylindermagneten von 2 Zoll Durchmesser und 1 Zoll Höhe wurde in dieser Studie verwendet. Die Pole des Magneten sind entlang der Achse ausgerichtet. Die Oberflächenmagnetflussdichte des Magneten ungefähr 1 T.

1. Magnetisieren die Stents diametral oder axial unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten. Halten Sie den Stent in der Nähe des starken Magneten für ca. 1 min für die Magnetisierung.
2. Halten des Stents an einer der ebenen Flächen mit einem Durchmesser entlang der magnetischen Feldlinien an diametral magnetisiert sein oder halten den Stent neben der zylindrischen Fläche, deren Achse entlang der magnetischen Feldlinien, um sie axial zu magnetisieren. Einbehaltene Magnet field des Stents wurde gefunden, daß für mindestens 24 Stunden stabil sein, sondern müssen über die Stents so bald wie möglich nach der Magnetisierung.
3. Montieren Sie die stents einzeln auf Glasdorne und hängen Sie dann das Glas Dorne in der Präzisionsspannfutter des magnetischen Sondenbefestigung. Magnetische Mikrosonde präzise ohne Berührung der Oberfläche mit der XYZ-Tische Anordnung der magnetischen Sondenvorrichtung (4) nahe dem Stent werden.
4. Messung der Basislinie Lesen der magnetischen Mikro weit weg vom Stent und dann den zurückgehalten Magnetfeld an der Stentoberfläche durch Positionierung der Sonde unter Verwendung der XYZ-Tische des magnetischen Sondenbefestigung.

4. Magnetzellaufnahmestudien

1. Gewinnung von Zellen, die Markierung mit SPION und Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff
   1. Leiten Sie die endothelialen Zellen Auswuchs (EOC) aus Schweine peripheren Blut wie in ^5,7 beschrieben. Kultur in einem T-75-Kolben until etwa 80% konfluent (5x10 ^{6 bis} 8x10 ^{6 Zellen).}
   2. Synthetisieren SPIONs als 10 nm Durchmesser _Magnetit (Fe 3 _O 4) Kern, umgeben von 50 nm dicke Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Schale nach ^8,9 beschrieben.
   3. Inkubieren des abgeleiteten EOC mit SPION bei einer Konzentration von 200 ug / ml Zellkulturmedium für 16 Stunden bei 37 ^o C.
   4. Saugen Sie das Zellkulturmedium sanft. Sanft die Zellen werden durch Zugabe von 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in den Kolben, schaukeln, und Absaugen des PBS.
   5. Färben die Zellen, die mit Fluoreszenzfarbstoff (CM-Dil) zur Visualisierung während der Experimente. Dies wird nach den Angaben des Herstellers durch Zugabe des Farbstoffs zu 10 ml Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5 & mgr; l / ml und Inkubation mit den Zellen für 30 min bei 37 ° C durchgeführt.
   6. Waschen der Zellen mit PBS wie in Schritt 4.1.4 und Inkubation mit 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C aufheben die Zellen aus dem Kolben.
   7. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, oben mit PBS gewaschen und bei 500 xg für 5 Minuten, um ein Zellpellet zu bilden.
   8. Re-suspendieren des Zellpellets in PBS bei einer Konzentration von 1-2x10 ^{& sup6; Zellen} / ml und gründlich durch Pipettieren in die und aus der konischen Röhrchen mehrere Male.
2. In-vitro-Zellstudien
   1. Design und zu verarbeiten (zum Beispiel 3D-Drucken) eine einfache Befestigung des Stents direkt über der Oberfläche eines Deckglases zu halten.
   2. Entmagnetisieren eines Stents unter Verwendung einer elektromagnetischen Degausser oder magnetisieren einen Stent diametral oder axial unter Verwendung einer starken Neodym-Magneten.
   3. Pipettieren Sie die SPION-markierten EOC in PBS in die Schüssel mit den axial magnetisiert oder diametral magnetisierte oder nicht-magnetisierten Kontrollstents suspendiert. Bild die Stents mit EOC in PBS unmittelbar für die Fluoreszenz suspendiert mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.

5. In-vivo-Tierstudien

1. Stentimplantation
   1. Zeichnen peripheres Blut von 4 gesunden Yorkshire Schweine - einem Gewicht von etwa 50 kg - 3 Wochen vor der Implantation bzw. Stent und Kultur EOC nach ^5,7 beschrieben.
   2. Verwalten Anti-Thrombozyten-Medikament, ab 3 Tage vor der Operation (Aspirin 325 mg und 75 mg Clopidogrel täglich).
   3. Auf der Stentimplantation Tag, betäuben die Schweine mit intramuskulären Telazol, Xylazin und Atropin (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg), wie in den geltenden institutionellen Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung angegeben.
   4. Intubieren und legen Sie das Schwein auf Einatmen von 1-2,5% Isofluran-Narkose.
   5. Rasieren Sie die ventralen Halsbereich des Schweins und führen das Verfahren im allgemeinen sterilen Bedingungen.
   6. Implantat 1 magnetisiert und 1 nichtmagnetisierten Stents in der rechten Koronararterie (RCA) unter Verwendung von Standardherzkathetertechnik.
      1. Katheterisierung von Tieren sollte durch eine ausgebildete interventioneller Kardiologe durchgeführt werden. Besuchen Sie das rechte Halsschlagader mit einem 9 Französisch Scheide.
      2. Kanülieren das Ziel der Herzkranzgefäße und injizieren jodhaltigen Kontrastfarbstoff zur Durchleuchtungsbilder zu erhalten.
      3. Legen Sie eine 0,014 Inch Standard koronaren Führungsdraht in die Arterie. Schieben Sie den Ballon und Stent mit diesen Führungsdraht und den Stent in einer 3-3,5 mm Durchmesser Schiffes.
   7. Verstopfen den Blutfluss innerhalb der RCA proximal der implantierten Stents unter Verwendung eines über dem Draht Ballon und liefern etwa 2x10 ⁶ autologe EOC mit SPION in 4 ml PBS über die Zentralkatheter über eine 2-minütige Zeitspanne ausgesetzt markiert.
   8. Wiederherstellung des Blutflusses zum RCA nach 2 min zusätzlicher Okklusion.
   9. Übertragen Sie das Tier in den Aufwachraum und das Tier genau zu überwachen, bis er wieder zu sich kam.
   10. Weiter zum Anti-Thrombozyten-Medikament zu verabreichen (325 mg Aspirin und Clopidogrel 75 mg) nach der Operation bis zum Opfer.
2. Stent Explantation und Histologie
   1. Euthanize der Tiere 7 Tage nach der Operation durch erste Betäubung des Tieres wie zuvor erläutert und dann intravenös verabreichen eine tödliche Dosis Natriumpentobarbital (100 mg / kg) nach geltenden institutionellen Animal Care und Verwenden Richtlinien.
   2. Chirurgisch Ernte der Stent arteriellen Segmenten. Fixierung der explantierten Arterien in 10% Formalin-Puffer für ein Minimum von 30 min. Lassen Sie die Proben in Formalin-Puffer für weitere histologische Analyse.
   3. Outsource die feste Probe zu Einrichtungen der Lage ist, die Histologie mit Metall-Stents. Während dieser Verarbeitung werden die Proben in Methylmethacrylat eingebettet werden, im Querschnitt, und mit Mallorys Färbetechnik mit Berliner Blau Färbung für Eisenpartikel histologisch analysiert.

Ergebnisse

Iterative Stentdesign basierend auf FEA (Abbildung 1) zeigte einen Stent, der Kräuselung und erweitern mit einer Hauptdehnung von 20%, die weniger als 30% der Bruchdehnung ist kann. Press- und Expansionstest (Abbildung 2) zeigte keine Anzeichen von Bruch. Fotos von der verformten Stent zeigte eine gute Übereinstimmung mit FEM berechneten Verformungen und auch Mikroskopie Bilder zeigten keine Frakturen (Abbildung 3). Wie aus dem Bilanzmagnetfeldmessungen ...

Diskussion

Wir entwickelten eine magnetische Stent, der als ein Bare-Metal-Stent funktionieren kann und SPION-markierten Endothelzellen zu gewinnen. In früheren Studien, bei denen magnetische Stents haben Forscher vernickelt kommerziellen Stents und Spulen oder Maschen aus magnetischen Materialien bestehen aufgrund der Nichtverfügbarkeit eines ferromagnetischen Stent ^5,10-14 verwendet. Andere Gruppen haben auch für die Ausrichtung von Nanopartikeln beladen Endothelzellen ³ verwendet die paramagnetischen Ch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation	N/A	Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems	N/A	Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00011674
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon	N/A	N/A	Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems	N/A	Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions	N/A	Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic	N/A	Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian