Endotel Hücre yakalama ve Saklanmasına İlişkin ferromanyetik Bare Metal Stent

Özet

Hedeflerimiz, tasarlamak, üretmek ve endotel hücre yakalama için ferromanyetik stent test edildi. On stent kırığı için test edildi ve 10 daha fazla stent muhafaza manyetik için test edildi. Nihayet, 10 stent in vitro test edildi ve 8 daha stent hücre yakalama ve tutma göstermek için 4 domuzlarda implante edildi.

Özet

Kardiyovasküler stentlerin hızlı endotelizasyonunun stent trombozu azaltmak ve kanama riskini azaltabilir, anti-trombosit tedavisi önlemek için gereklidir. Süper paramanyetik demir oksit nanopartiküller (casus) ile işaretlenmiş endotel hücreleri akıbet (EOC) yakalamak ve korumak için manyetik kuvvetler kullanarak fizibilite önceden gösterilmiştir. Ancak bu teknik, hızlı endotelizasyon kanıtlamak için in vitro ve in vivo test ardından manyetik ve biyo-uyumlu bir malzemeden, mekanik olarak işlevsel bir stent geliştirilmesini gerektirmektedir. Biz bilgisayar destekli tasarım (CAD) kullanarak 2205 dubleks paslanmaz çelikten zayıf ferromanyetik stent geliştirdi ve tasarımı daha da sonlu elemanlar analizi (FEA) kullanılarak rafine edilmiştir. Stentin nihai tasarım, mekanik kıvırma ve genişleme sırasında malzemenin kırılma sınırının altında bir ana zorlanma sergiledi. Yüz stent imal edildi ve bunların bir alt kümesi mekanik test, ret kullanılmıştırained manyetik alan ölçümleri, in-vitro hücre yakalama çalışmaları ve in vivo implantasyon çalışmaları. On stent onlar arızasız döngüsünü sıkma ve genişleme sürdürülebilir olmadığını doğrulamak için dağıtım için test edildi. Başka bir 10 stentler, güçlü bir neodimyum mıknatıs kullanarak mıknatıslanmamış ve bunların muhafaza manyetik alan ölçüldü. Stentler muhafaza manyetizma eden in vitro çalışmalarda spion etiketli EOC yakalamak için yeterli olduğunu göstermiştir. Spion etiketli EOC yakalama ve tutma 1 manyetize stent ve 4 domuz her 1 olmayan manyetize edilmiş kontrol stent implante büyük hayvan modellerinde doğrulanmıştır. Stentli arterler 7 gün sonra eksplante ve histolojik olarak incelendi. Bu çalışmada geliştirilen zayıf manyetik stentler çeken ve hızlı iyileşmeyi teşvik edebilir spion etiketli endotel hücrelerini tutabilen idi.

Giriş

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Bir 2205 Paslanmaz Çelik Stent 1. Tasarımı ve Analizi

1. CAD kullanarak çıplak metal stent Tasarımı
   1. Stent payanda kalınlığına eşit et kalınlığına sahip 'ekstrüde patron / baz' özelliği seçerek haddelenmiş oyuk bir silindir yapın.
   2. Haddelenmiş silindir teğet farklı bir skeç düzlemde bir stent desen tasarlayın. Haddelenmiş oyuk silindirin çevresini maç düz desen genişliğini olun.
   3. Şal özelliğini kullanarak boş silindirin üzerine düz desen tasarımı aktarın.
   4. Kendi özgün biçiminde ve aynı zamanda FEA için ihraç edilecek ACIS biçiminde bir bölümünü kaydedebilirsiniz.
2. Stent modelleri için sonlu elemanlar analizi
   1. Daha fazla analizi kullanılmıştır için FEA yazılımının bir parçası modülüne ACIS formatında kaydedilen katı geometri İthalatolduğunu.
   2. FEA yazılımının bir parçası modelleyici içinde stent koaksiyal 2 analitik silindir Model. Dış silindir kıvırma simüle etmek için stent çapından bir başlangıç ​​çapı daha büyük olan ve iç silindir enflasyonu bir balon simüle etmek için 1 mm'lik bir başlangıç ​​çapına sahiptir.
   3. Above monte montaj modelleyicinin 'örneklerini' ağaç öğesi üzerine çift tıklayın göreli konumları parçaları söyledi.
   4. Indirgenmiş entegrasyonu ile 20 düğüm hexahedral elemanı olarak eleman türünü belirtin, FEA yazılımı örgü modülünü kullanın eleman boyutunu belirtin ve stent örgü.
   5. Stent ve model ağacı 'etkileşim özelliklerinin' sırasıyla iki silindir arasındaki sürtünmesiz sert kontakt çiftleri belirleyin.
   6. Stent modeline 2205 paslanmaz çelikten elasto-plastik gerilme-deformasyon davranışını atayın.
   7. Öncelikle c taklit 1 mm dış silindir kıvrım için sınır şartları tanımlayınstentin Rimping. Kıvrılmış stentin gevşeme simüle etmek için dış silindiri çıkartın. Genişleme simüle etmek için 3 mm iç silindir genişletin ve nihayet, stent geri tepme simüle etmek için iç silindir çıkarın.
   8. 'Analiz' modeli ağaç kaleminde ayrılan işlemci ve RAM miktarı sayısı dahil simülasyon parametreleri tanımlayın ve simülasyon çalıştırın.
   9. Simülasyon tamamlandıktan sonra, ana suşları incelemek için sonuçlar Sonuç dosyası (filename.odb) ve post-process açın ve iteratif malzeme hatası sınırından daha az% 20 anapara gerginlik elde etmek için stent tasarımını geliştirmek .

Sıkma ve Genişleme 2. Stent İmalatı ve Test

1. Stent fabrikasyon
   1. Böyle Pioneer Eylem Hassas Ürünler olarak bir hassas işleme şirketi de silah sondaj ve hassas taşlama çubuk stok malzeme ile 2205 paslanmaz çelik borular elde etmek,OH.
   2. Lazer kesim ve elektro böyle Waukegan, IL Laserage Technology Corporation olarak stent kesme şirkete hassas taşlanmış tüpleri ve düz model stent tasarımı aktarın.
   3. Başka bir 10 dakika boyunca, bir baz (% 10 NaHCO _3), ardından 10 dakika boyunca kuvvetli bir asit (50% HCI) bunları batırmak suretiyle elektro-stent yüzey pasifleştirilmesi. DİKKAT: Uygun koruyucu ekipman ve davlumbaz altında kimyasal anlaştım. Son olarak, bir etil alkol ve deiyonize su ile stent yıkayın. Bu işlem, asit temizleme adlandırılır.
2. Kıvırma ve genişleme için imal stent Testi
   1. Aracı Sıkma bir el kullanarak üç katlı balonu üzerine stenti kıvırın. Stent ve sıkma aracı üç katlı balon tutun. Radyal balon kıvrılır edilecek stent deforme için kolu basın.
   2. Üniforma sıkma için bir mikroskop ve bağlı yapıda başarısızlık herhangi bir işaret kullanılarak kıvrımlı stent inceleyinplastik deformasyona.
   3. Su ile üç katlı balon basınç ile 3 mm tasarlanmış çapa genişletin. Mikroskobik kırıklar ve uniform genişleme için genişletilmiş stentler inceleyin.

Tutulan Manyetik Alan için Stent 3. Karakterizasyonu

Not: 2 inç çapında ve 1 inç yüksekliğinde plastik bir silindir mıknatıs bu çalışmada kullanılmıştır. Mıknatıs kutupları ekseni boyunca hizalanır. Mıknatısın yüzey manyetik akı yoğunluğu yaklaşık T. 1

1. Güçlü neodimyum mıknatıs kullanarak taban tabana veya eksenel stent çekmek. Mıknatıslanma yaklaşık 1 dakika boyunca güçlü mıknatıs yakın stent tutun.
2. Taban tabana manyetize veya eksenel ve mıknatısla manyetik alan çizgileri boyunca kendi ekseni ile silindirik yüzeye sonraki stent tutun edilecek manyetik alan çizgileri boyunca çapı düz yüzeylerinden birine stent tutun. Tutulan manyetik fielstentin d, en az 24 saat süre ile stabil olabilir, ama manyetizasyon sonra mümkün olan en kısa sürede stent bulunmuştur.
3. Cam mandreller üzerine tek tek stent monte edin ve daha sonra manyetik sondalama fikstür hassas aynasının cam millerini monte edin. Manyetik mikrosensor prob tam XYZ manyetik sondalama fikstür montajını aşamaları kullanarak yüzeyi (Şekil 4) dokunmadan stent yakın yerleştirilmiş olabilir.
4. Uzakta stent manyetik mikrosensor bazal okuma ölçün ve sonra manyetik sondalama fikstür XYZ aşamalarını kullanarak prob konumlandırarak stent yüzeyine muhafaza manyetik alan ölçer.

4. Manyetik Hücre Yakalama Çalışmaları

1. Elde edilmesi hücreleri, floresan boya ile spion ve boyama ile markalama
   1. ^5,7 anlatıldığı gibi domuz periferik kandan endotel hücreleri akıbet (EOC) türevi. Unti T-75 balonuna Kültürl yaklaşık% 80 konfluent (5x10 ^{6 6} 8x10 için hücre).
   2. 10 nm çapında manyetit (Fe ₃ O ₄₎ ^8,9 de tarif edildiği gibi 50 nm kalınlığında bir poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) Kabuk ile çevrili temel olarak SPIONs sentezleme.
   3. ³⁷ o C'de 16 saat süre ile hücre kültür ortamında 200 ug / ml bir konsantrasyonda spion türetilen EOC inkübe
   4. Yavaşça hücre kültür ortamı aspire. Yavaşça, şişeye, fosfat tamponlu salin (PBS), 10 ml ekleyerek sallanan ve PBS aspire hücreleri yıkayın.
   5. Deneyler sırasında görselleştirmek için floresan boya (CM-DII) olan hücreleri leke. Bu 5 ul / ml arasında bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamı 10 ml boya eklenmesi ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için hücreler ile inkübe edilerek, üretici talimatlarına göre yapılır.
   6. Aşama 4.1.4 gibi hücrelerin PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 3 ml inkübeşişeden hücreler kaldırın.
   7. 5 dakika bir hücre tanesinin meydana getirmek üzere, 500 xg PBS ile bir 15 mL konik tüp üst hücre süspansiyonu kapalı transferi ve santrifüjlenir.
   8. 1-2x10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda PBS içinde hücre pelletini yeniden askıya ve birkaç kez ve konik tüp üzerinden pipetleme ile iyice karıştırın.
2. In vitro hücre çalışmaları
   1. Tasarım ve fabricate (örneğin, 3D baskı) sadece cam lamel yüzeyi üzerinde stenti tutmak için basit bir fikstür.
   2. Elektromanyetik degausser kullanarak bir stent manyetikliğini ya da güçlü bir neodimyum mıknatıs kullanarak taban tabana veya eksenel bir stent çekmek.
   3. Eksenel manyetize ya taban tabana manyetize ya da olmayan manyetize kontrol stentler içeren çanak içine PBS içinde asılı spion etiketli EOC pipetle. Resim ters bir floresan mikroskobu kullanılarak hemen floresan PBS içinde süspansiyon haline getirilmiş EOC olan stent.

5. In-vivo Hayvan Araştırmaları

1. Stent implantasyonu
   1. 4 sağlıklı Yorkshire domuz periferik kan Draw - ^5,7 açıklandığı gibi 3 hafta önce sırasıyla implantasyonu stent ve kültür EOC için - yaklaşık 50 kg ağırlığındaki.
   2. (Günlük aspirin 325 mg ve klopidogrel 75 mg) ameliyat 3 gün önce başlayan anti-trombosit ilaç yönetmek.
   3. Stent yerleştirme gününde, kas içi Telazol, Xylazine ve Atropin ile domuz uyutmak (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg sırasıyla) uygulanabilir kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı kurallarda belirtildiği gibi.
   4. Entübe ve 1-2,5% İsofluranın anestezi inhalasyon üzerine domuz yerleştirin.
   5. Domuz ventral boyun bölgesini Tıraş ve genel steril şartlarda prosedürü yürütmek.
   6. İmplant manyetize 1 ve standart kalp kateterizasyonu tekniği kullanılarak sağ koroner artere (RCA) içine 1 olmayan manyetize stent.
      1. CatheteHayvanların haklara ait eğitimli girişimsel kardiyoloji tarafından yapılmalıdır. 9 Fransız kılıf ile sağ karotis arter erişin.
      2. Hedef koroner arterin cannulate ve skopi görüntüler elde etmek için iyotlu kontrast boya enjekte edilir.
      3. Arterdeki bir 0.014 inçlik standart koroner kılavuz teli yerleştirin. Balon Advance ve bu kılavuz teli kullanarak stent ve 3-3.5 mm çapında bir kap içinde stent dağıtın.
   7. Tel balonu üzerinde kullanılarak implante stent RCA proksimal içindeki kan akışını tıkamak ve 2 dakikalık bir süre boyunca merkezi bir kateter yardımı ile PBS 4 ml süspansiyon haline spion ile etiketlenmiş yaklaşık 2x10 ⁶ otolog EOC sağlar.
   8. Ek tıkanıklığı 2 dakika sonra RCA kan akışını geri yükleyin.
   9. Ayılma odasına hayvan aktarın ve bilinci yerine kadar yakından hayvan izleyin.
   10. Anti-trombosit ilaç yönetmek devam (aspirin 325 mg ve klopidogrel 75 mg) Kurban kadar ameliyat sonrası.
2. Stent eksplant ve histoloji
   1. Daha önce açıklandığı gibi ilk hayvan anestezi ile hayvanlar ameliyat sonrası 7 gün Euthanize ve daha sonra damardan uygulanan kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak sodyum pentobarbital (100 mg / kg) bir öldürücü dozunu.
   2. Cerrahi stent arter segmentleri hasat. 30 dakika en az% 10 formalin tamponu içinde eksplante arterleri düzeltildi. Daha histolojik analiz için formalinle tampon örnekleri bırakın.
   3. Metal stent ile histoloji yapabilen tesislere sabit numune Outsource. Bu işlem sırasında, numune, metilmetakrilat katıştırmak çapraz kesit ve demir parçacıkları Prusya mavisi boyası ile Mallory'nin boyama tekniği kullanılarak histolojik olarak değerlendirildi.

Sonuçlar

FEA (Şekil 1) dayalı iteratif stent tasarımı kıvrım ve% 30 nihai gerginlik daha azdır% 20 anapara zorlanma ile genişletebilirsiniz stent gösterdi. Sıkma ve genişleme testi (Şekil 2) kırık bulgusuna rastlanmadı. Deforme stentin Resimleri FEA hesaplanan deformasyonlar iyi anlaşmayı gösterdi ve aynı zamanda mikroskopi resimler hiçbir kırıklarına (Şekil 3) gösterdi. Muhafaza manyetik alan ölçümleri (Şekil 4 ve 5) beklendi?...

Tartışmalar

Biz çıplak metal stent olarak işlev görebilir ve casus etiketli endotel hücrelerini çekebilecek bir manyetik stent geliştirdi. Manyetik stent kapsayan önceki çalışmalarda, araştırmacılar nedeniyle ferromanyetik stent ^5,10-14 olmayışı manyetik malzemelerden yapılmış nikel kaplamalı ticari stent ve bobinler veya kafesleri kullandık. Diğer gruplar da nanoparçacık yüklü endotel hücrelerini ³ hedefleme için piyasada mevcut 304 kalite paslanmaz çelik stent paramanyetik doğa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation	N/A	Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems	N/A	Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00011674
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon	N/A	N/A	Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems	N/A	Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions	N/A	Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic	N/A	Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian