Bare Metal Stent ferromagnetico per Capture cellule endoteliali e conservazione

Riepilogo

I nostri obiettivi erano di progettare, produrre e testare stent ferromagnetici per la cattura delle cellule endoteliali. Dieci stent sono stati testati per la frattura e altre 10 stent sono stati testati per magnetismo mantenuto. Infine, 10 stent sono stati testati in vitro e altre 8 stent sono stati impiantati in 4 maiali per mostrare la cattura e la conservazione delle cellule.

Abstract

È necessario un rapido endotelizzazione di stent cardiovascolari per ridurre la trombosi dello stent e per evitare la terapia anti-piastrinica che può ridurre il rischio di sanguinamento. La possibilità di utilizzare forze magnetiche per catturare e trattenere le cellule endoteliali escrescenza (EOC) marcate con nanoparticelle di ossido di ferro super-paramagnetiche (spion) è stato indicato in precedenza. Ma questa tecnica richiede lo sviluppo di uno stent meccanicamente funzionale da un materiale magnetico e biocompatibile seguita da in-vitro e in vivo alcune prove endotelizzazione rapida. Abbiamo sviluppato uno stent debolmente ferromagnetico in acciaio inox 2205 duplex utilizzando computer aided design (CAD) e il suo design è stata ulteriormente raffinata con analisi agli elementi finiti (FEA). Il disegno finale dello stent mostrato una deformazione principale sotto del limite frattura del materiale durante crimpatura meccanica ed espansione. Cento stent sono stati fabbricati e un loro sottoinsieme è stato utilizzato per prove meccaniche, retained misure di campo magnetico, studi in vitro di cattura delle cellule, e in vivo studi di impianto. Dieci stent sono stati testati per la distribuzione per verificare se sono sostenuti aggraffatura e l'espansione del ciclo senza guasti. Altri 10 sono stati magnetizzati con stent un forte magnete al neodimio e il loro campo magnetico conservato è stato misurato. Gli stent hanno mostrato che il magnetismo trattenuto era sufficiente a catturare spion marcato EOC nei nostri studi in vitro. Spion marcato EOC cattura e la conservazione sono stati verificati in modelli animali di grandi dimensioni mediante l'impianto di stent 1 magnetizzato e 1 stent controllo non magnetizzato in ognuno dei 4 maiali. Le arterie stent sono stati espiantati dopo 7 giorni e analizzati istologicamente. Gli stent debolmente magnetici sviluppati in questo studio sono stati in grado di attrarre e trattenere le cellule endoteliali spion marcato che possono promuovere una rapida guarigione.

Introduzione

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Utilization (IACUC) presso la Mayo Clinic.

1. Progettazione e analisi di un 2205 in acciaio inossidabile Stent

1. Progettare un stent di metallo nudo con CAD
   1. Effettuare un cilindro cavo estruso selezionando in funzione 'Estrusione / base' con lo spessore di parete pari allo spessore stent puntone.
   2. Progettare un modello di stent su un piano di schizzo diverso tangente al cilindro estruso. Effettuare la larghezza del modello piatto per abbinare la circonferenza del cilindro cavo estruso.
   3. Trasferire sul cilindro cavo utilizzando la funzione di avvolgere il design modello piatto.
   4. Salvare la parte nel suo formato nativo e anche in formato ACIS deve essere esportato per FEA.
2. Analisi agli elementi finiti per i modelli stent
   1. Importare la geometria solida salvato in formato ACIS nel modulo parte del software FEA per ulteriori analysè.
   2. Modello 2 cilindri analitici coassialmente allo stent nella parte modellatore del software FEA. Il cilindro esterno ha un diametro iniziale maggiore del diametro dello stent per simulare la pressa e il cilindro interno ha un diametro iniziale di 1 mm per simulare un pallone per gonfiaggio.
   3. Fare doppio clic sulla voce di albero del modellatore assemblea 'casi' di montare sopra dette parti in posizioni relative.
   4. Utilizzare il modulo di maglia del software FEA, specificare il tipo di elemento come 20 nodi elemento esaedrica con l'integrazione ridotta, specificare le dimensioni dell'elemento, e maglie dello stent.
   5. Specificare attrito coppie a contatto rigide tra lo stent e due cilindri, rispettivamente nelle "Proprietà" della interazione del modello.
   6. Assegnare comportamento sforzo-deformazione elasto-plastico di acciaio inossidabile 2205 al modello dello stent.
   7. Definire condizioni al contorno per crimpare primo luogo il cilindro esterno di 1 mm che simula il cRimping dello stent. Rimuovere il cilindro esterno per simulare il rilassamento dello stent crimpato. Espandere il cilindro interno di 3 mm per simulare l'espansione e, infine, rimuovere il cilindro interno per simulare recoil dello stent.
   8. Definire i parametri di simulazione, tra cui il numero di processori e quantità di RAM allocati nella voce albero modello di 'Analisi' ed eseguire la simulazione.
   9. Una volta che la simulazione, aprire il file risultato (filename.odb) e post-elaborare i risultati di studiare le deformazioni principali e migliorare iterativamente il disegno stent per ottenere una deformazione principale del 20%, che è inferiore al limite cedimento del materiale, .

2. Stent fabbricazione e la sperimentazione per la piegatura e di espansione

1. Stent fabbricazione
   1. Ottenere i tubi in acciaio inossidabile 2205 di pistola foratura e molatura di precisione barra magazzino materiale presso una società di lavorazioni meccaniche di precisione, come azione di precisione Prodotti in Pioneer,OH.
   2. Trasferire i tubi a terra di precisione e il modello di progettazione dello stent piatta ad una società di stent taglio come Laserage Technology Corporation a Waukegan, IL per taglio laser e elettrolucidatura.
   3. Passivare la superficie degli stent elettrolucidate da essi submersing in un acido forte (50% HCl) per 10 minuti seguiti da una base (10% _NaHCO3) per altri 10 min. ATTENZIONE: maneggiare sostanze chimiche con i dispositivi di protezione adeguata e sotto una cappa aspirante. Infine, lavare gli stent con alcool etilico e acqua deionizzata. Questo processo è chiamato decapaggio acido.
2. Prove di stent fabbricati per la piegatura e l'espansione
   1. Crimp lo stent su un pallone a tre ante con una mano tesa strumento di piegatura. Tenere lo stent e il pallone a tre ante in pinza. Premere la maniglia per deformare radialmente lo stent da crimpare sul pallone.
   2. Ispezionare lo stent a pressare utilizzando un microscopio per uniforme aggraffatura e qualsiasi segno di fallimento nella struttura a causaper deformazione plastica.
   3. Espanderlo al diametro progettato 3 mm pressurizzando il palloncino a tre ante con acqua. Esaminare gli stent espanso per le fratture microscopiche e l'espansione uniforme.

3. Caratterizzazione di stent per Retained Campo Magnetico

NOTA: magnete cilindrico del diametro di 2 pollici e 1 pollice di altezza è stato utilizzato in questo studio. I poli del magnete sono allineate lungo l'asse. La densità di flusso magnetico superficiale del magnete è di circa 1 T.

1. Magnetizzare gli stent diametralmente o assiale con un forte magnete al neodimio. Tenere il stent vicino al magnete forte per circa 1 min per la magnetizzazione.
2. Tenere il stent su una delle facce piane con il suo diametro lungo le linee del campo magnetico per essere magnetizzate diametralmente o tenere lo stent accanto alla superficie cilindrica con asse lungo le linee del campo magnetico per magnetizzare assialmente. Fiel magnetico a nuovod dello stent è risultato essere stabile per almeno 24 ore, ma utilizzare lo stent non appena possibile dopo magnetizzazione.
3. Montare gli stent individualmente su mandrini di vetro e poi montare i mandrini di vetro nel mandrino precisione dell'apparecchio sondaggio magnetica. Sonda microsensore magnetica può essere posizionata con precisione vicino allo stent senza toccare la superficie con la XYZ fasi di montaggio del dispositivo di tastatura magnetica (Figura 4).
4. Misurare la lettura basale della microsensore magnetico lontano dallo stent e quindi misurare il campo magnetico trattenuto sulla superficie dello stent posizionando la sonda con le fasi XYZ del proiettore tastatura magnetica.

4. magnetici Studi cellulare Capture

1. Ottenere cellule, l'etichettatura con spion e colorazione con colorante fluorescente
   1. Derivare le cellule endoteliali escrescenza (EOC) da sangue periferico suino come descritto in ^5,7. Cultura in un pallone T-75 until circa l'80% confluenti (5x10 ^{6 a} 8x10 ^{6 cellule).}
   2. Sintetizzare SPIONs come diametro di 10 nm magnetite (Fe _{3 O 4)} nucleo circondato da 50 poli di spessore nm (lattico-co-glicolico acido) (PLGA) Coperture come descritto in ^8,9.
   3. Incubare la EOC derivato con spion ad una concentrazione di 200 ug / ml di mezzo di coltura cellulare per 16 ore ^a 37 ° C.
   4. Aspirare il mezzo di coltura cellulare delicatamente. Lavare delicatamente le cellule aggiungendo 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) al pallone, dondolo, e aspirare il PBS.
   5. Colorare le cellule con colorante fluorescente (CM-DII) per la visualizzazione durante gli esperimenti. Ciò avviene secondo le istruzioni del fabbricante aggiungendo il colorante a 10 ml di mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione di 5 microlitri / ml e incubando le cellule con per 30 minuti a 37 ° C.
   6. Lavare le cellule con PBS come al punto 4.1.4 e incubare con 3 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C persollevare le cellule dal pallone.
   7. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml, rabboccare con PBS e centrifugare a 500 xg per 5 min a formare un pellet di cellule.
   8. Risospendere il pellet cellulare in PBS ad una concentrazione di 1-2x10 ⁶ cellule / ml e miscelare accuratamente pipettando in e fuori del tubo conico più volte.
2. Studi in vitro di cellule
   1. Progettare e fabbricare (ad esempio, stampa 3D) un semplice attrezzo per tenere lo stent appena sopra la superficie di un vetrino di vetro.
   2. Smagnetizzare uno stent utilizzando un degausser elettromagnetica o magnetizzare uno stent diametralmente o assiale con un forte magnete al neodimio.
   3. Pipettare il EOC spion marcato sospesa in PBS nel piatto contenente gli stent di controllo assiale magnetizzati o diametralmente magnetizzate o non magnetizzate. Immagine gli stent con EOC sospesa in PBS immediatamente per la fluorescenza usando un microscopio a fluorescenza invertito.

5. in vivo Animal Studies

1. Impianto di stent
   1. Disegna sangue periferico da 4 maiali Yorkshire sani - peso di circa 50 kg - tre settimane prima di impianto di stent, rispettivamente, e la cultura EOC come descritto in ^5,7.
   2. Somministrare farmaci anti-piastrinici di partenza 3 giorni prima dell'intervento (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg al giorno).
   3. Il giorno impianto dello stent, anestetizzare i maiali con intramuscolare Telazol, Xilazina, e atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, rispettivamente), come indicato nelle linee guida istituzionali applicabili cura degli animali e l'uso.
   4. Intubare e posizionare il maiale inalazione di 1-2,5% anestesia isoflurano.
   5. Radere la regione ventrale del collo del maiale e condurre la procedura in condizioni sterili generali.
   6. Implant 1 magnetizzato e 1 stent non magnetizzato nell'arteria coronaria destra (RCA) usando la tecnica di cateterizzazione cardiaca standard.
      1. Catheterizzazione di animali deve essere effettuata da un cardiologo interventista addestrato. Accedere alla carotide destra con una guaina French 9.
      2. Incannulare l'obiettivo coronarica e iniettare mezzo di contrasto iodato per ottenere immagini fluoroscopiche.
      3. Mettere un filo guida coronarico standard di 0.014 pollici nell'arteria. Far avanzare il palloncino e stent utilizzando questo filo guida e distribuire il stent in un vaso di diametro 3-3,5 mm.
   7. Occludere il flusso di sangue all'interno prossimale RCA agli stent impiantati utilizzando un over pallone filo e fornire circa 2x10 ⁶ EOC autologo marcato con spion sospeso in 4 ml di PBS attraverso il catetere centrale su un periodo di 2 min.
   8. Ripristinare il flusso di sangue al RCA dopo 2 min di occlusione aggiuntivo.
   9. Trasferire l'animale alla sala di risveglio e monitorare attentamente l'animale fino a che non ha ripreso conoscenza.
   10. Continuare a somministrare farmaci anti-piastrinici (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg) inviare operativamente fino sacrificio.
2. Espianto stent e istologia
   1. Euthanize gli animali 7 giorni dopo l'intervento dapprima anestetizzare l'animale come spiegato precedentemente e quindi somministrare per via endovenosa una dose letale di pentobarbital sodio (100 mg / kg) secondo le linee guida istituzionali applicabili cura degli animali e di uso.
   2. Chirurgicamente raccogliere i segmenti arteriosi stent. Fissare le arterie espiantati in 10% formalina tampone per almeno 30 min. Lasciare i campioni in buffer di formalina per ulteriori analisi istologica.
   3. Esternalizzare il campione fissato alle strutture in grado di svolgere l'istologia con stent di metallo. Durante questo processo, i campioni vengono incorporare in metilmetacrilato, in sezione, e analizzati istologicamente usando la tecnica di colorazione di Mallory con Prussia macchia blu per particelle di ferro.

Risultati

Disegno stent iterativo basato su FEA (Figura 1) ha mostrato uno stent che può crimpare ed espandere con un ceppo principale 20%, che è inferiore al 30% deformazione ultima. Piegatura e di prova di espansione (Figura 2) non ha mostrato segni di frattura. Immagini di stent deformato mostrato buon accordo con deformazioni FEA calcolate e anche foto microscopia mostrato fratture (Figura 3). Come previsto dalle misure di campo magnetico a nuovo (figure 4 e 5...

Discussione

Abbiamo sviluppato uno stent magnetica che può funzionare come un stent di metallo nudo e in grado di attirare le cellule endoteliali spion marcato. In studi precedenti che coinvolgono stent magnetici, i ricercatori hanno usato nichel stent rivestiti commerciali e bobine o mesh in materiali magnetici a causa della indisponibilità di uno stent ferromagnetico ^5,10-14. Altri gruppi hanno usato anche la natura paramagnetica attualmente in commercio stent in acciaio inox 304-grado per il targeting di nanopartice...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation	N/A	Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems	N/A	Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00011674
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon	N/A	N/A	Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems	N/A	Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions	N/A	Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic	N/A	Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian