Bare Metal פרומגנטי סטנט ללכיד תא האנדותל ושייר

Summary

המטרות שלנו היו לעצב, לייצר ולבדוק סטנטים פרומגנטי ללכידת תא האנדותל. עשרה סטנטים נבדקו לשברים ועוד 10 סטנטים נבדקו למגנטיות עודפים. לבסוף, 10 סטנטים נבדקו ב- מבחנה ו8 יותר סטנטים הושתלו ב -4 חזירים להראות ללכוד תאים ושמירה.

Abstract

יש צורך endothelialization המהיר של סטנטים לב וכלי דם כדי להפחית פקקת סטנט ולהימנע מטיפול אנטי-טסיות שיכול להפחית את הסיכון לדימום. הכדאיות של שימוש כוחות מגנטיים כדי ללכוד ולשמר תאי האנדותל תולדה (EOC) שכותרתו עם חלקיקי תחמוצת ברזל סופר פאראמגנטיים (SPION) הוכחה בעבר. אבל טכניקה זו מחייבת פיתוח של סטנט מכאני פונקציונלי מחומר מגנטי וביולוגי ואחריו חוץ גופייה וב- vivo בדיקות כדי להוכיח endothelialization המהיר. פיתחנו סטנט חלש פרומגנטי מפלדת אל-חלד 2,205 דופלקס באמצעות תכנון בעזרת מחשב (CAD) והעיצוב שלה היה מעודן יותר באמצעות ניתוח אלמנטים סופי (FEA). העיצוב הסופי של סטנט הציג זן עיקרי מתחת לגבול שבר של החומר במהלך crimping והרחבה מכאניים. מאה סטנטים יוצרו ותת-קבוצה שלהם שימשה לבדיקות מכאניות, מילained מדידות שדה מגנטיות, ב- מבחנה ללכוד תאים, וב- vivo מחקרי השתלה. עשרה סטנטים נבדקו לפריסה כדי לוודא אם שנגרמו להם ולהרחבת מעגל crimping ללא כשל. עוד 10 סטנטים היו ממוגנטים באמצעות מגנט ניאודימיום חזק והשדה המגנטי שמרה נמדד. סטנטים הראו כי המגנטיות נשמרת הייתה מספיק כדי ללכוד EOC כותרת SPION במחקרים במבחנה שלנו. לכידת EOC כותרת SPION ושימור אומתו במודלים של בעלי חיים גדולים על ידי השתלת סטנט 1 ממוגנט ו1 סטנט שליטה שאינה ממוגנט בכל אחד מ4 חזירים. עורקי stented היו explanted לאחר 7 ימים ונותחו בהיסטולוגיה. סטנטים חלשים המגנטיים שפותחו במחקר זה היו מסוגלים למשוך ושמירת תאי האנדותל שכותרת SPION אשר יכול לקדם ריפוי מהיר.

Introduction

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי ווועדה ניצול (IACUC) במרפאת מאיו.

1. עיצוב וניתוח של נירוסטה סטנט 2,205

1. עיצוב סטנט מתכת חשוף באמצעות CAD
   1. הפוך גליל חלול extruded על ידי בחירה בתכונה 'בוס / בסיס extruded' עם עובי הדופן שווה עובי יתד סטנט.
   2. עיצוב תבנית סטנט על מטוס סקיצה שונה משיק לגליל extruded. הפוך את רוחב התבנית השטוחה כדי להתאים את היקפו של הגליל החלול extruded.
   3. העבר את עיצוב התבנית השטוח על גבי הגליל החלול באמצעות התכונה לעטוף.
   4. שמור את החלק בפורמט המקורי שלו וגם בפורמט ACIS להיות מיוצא לFEA.
2. ניתוח אלמנטים סופי עבור דגמי סטנט
   1. לייבא את הגיאומטריה המוצקה נשמרה בפורמט ACIS למודול חלק מתוכנת FEA לanalys נוסףהוא.
   2. מודל 2 צילינדרים אנליטיים coaxially לסטנט בModeler החלק מתוכנת FEA. הגליל החיצוני יש קוטר ראשוני גדול יותר מאשר הקוטר של סטנט כדי לדמות את crimper ויש הגליל הפנימי קוטר ראשוני של 1 מ"מ כדי לדמות בלון לאינפלציה.
   3. לחץ לחיצה כפולה על פריט העץ 'מקרי' של Modeler ההרכבה להרכיב מעל אמרה חלקים בעמדות ביחס.
   4. להשתמש במודול הרשת של תוכנת FEA, לציין את סוג האלמנט כאלמנט משושה 20-צומת עם אינטגרציה מופחתת, ציין את גודל האלמנט, ורשת סטנט.
   5. ציין קשר זוגות נוקשה חיכוך בין סטנט ושני צילינדרי בהתאמה ב'מאפייני האינטראקציה 'של עץ הדגם.
   6. הקצאת אלסטו-פלסטי מתח מתח התנהגות של 2205 נירוסטה למודל סטנט.
   7. הגדר את תנאי גבול לcrimp ראשית הגליל החיצוני 1 מ"מ המדמה את גרימפינג של סטנט. הסר את הגליל החיצוני כדי לדמות את ההרפיה של סטנט המסולסל. הרחב את הגליל הפנימי 3 מ"מ כדי לדמות הרחבה ולבסוף, להסיר את הגליל הפנימי כדי לדמות רתיעה של סטנט.
   8. הגדר את הפרמטרים הסימולציה כולל מספר המעבדים וכמות זיכרון RAM שהוקצו במסגרת הסעיף "ניתוח" מודל העץ ולהפעיל את הסימולציה.
   9. ברגע שהסימולציה היא מלאה, לפתוח את קובץ התוצאה (filename.odb) ולאחר תהליך התוצאות ללמוד זנים העיקריים וiteratively לשפר את עיצוב סטנט כדי להשיג מתח עיקרי של 20% שהוא פחות מגבול הכישלון של החומר .

2. ייצור סטנט ובדיקה ללחיצה ו הרחבה

1. ייצור סטנט
   1. להשיג 2,205 צינורות נירוסטה על ידי קידוח אקדח וחומר שורת מניות טחינת דיוק בחברת עיבוד שבבי מדויקת כגון מוצרי Precision פעולה בפיוניר,OH.
   2. העברת צינורות קרקע הדיוק ועיצוב סטנט הדפוס השטוח לחברת סטנט החיתוך כגון חברת הטכנולוגיה Laserage בWaukegan, IL לחיתוך לייזר ואלקטרו.
   3. Passivate את פני השטח של סטנטים electropolished ידי submersing בחומצה חזקה (50% HCl) במשך 10 דקות ואחריו בסיס (10% NaHCO ₃₎ לעוד 10 דקות. זהירות: להתמודד עם כימיקלים ציוד מגן מתאים ומתחת למכסת מנוע קטר. לבסוף, לשטוף את סטנטים עם אתיל אלכוהול ומים ללא יונים. תהליך זה נקרא כבישת חומצה.
2. בדיקה של סטנט מיוצר עבור crimping והרחבה
   1. לחיצה על סטנט בלון שלושה קיפולים באמצעות כף יד crimping כלי. החזק את הסטנט והבלון השלושה קיפולים בכלי crimping. לחץ על הידית כדי לעוות רדיאלית סטנט להיות crimped על הבלון.
   2. בדוק את הסטנט המסולסל באמצעות מיקרוסקופ לcrimping אחיד וכל סימנים של כשל במבנה עקבלדפורמציה פלסטית.
   3. להרחיב אותו לקוטר של 3 מ"מ שנועד על ידי pressurizing בלון השלושה קיפולים עם מים. בדוק את סטנטים מורחבים לשברים מיקרוסקופיים והרחבה אחידה.

3. אפיון של סטנט לשדה מגנטי עודף

הערה: מגנט גלילי של גובה 2 אינץ 'קוטר 1 אינץ' ושמשה במחקר זה. הקטבים של המגנט מיושרים לאורך הציר. צפיפות השטף מגנטי פני השטח של המגנט היא כ 1 ט

1. למגנט סטנטים לחלוטין או axially באמצעות מגנט ניאודימיום חזק. החזק את הסטנט קרוב למגנט החזק לכ 1 דק 'למגנוט.
2. החזק את הסטנט על אחד הפרצופים שטוחים בקוטר שלה לאורך קווי השדה המגנטיים להיות ממוגנטים לחלוטין או להחזיק את הסטנט בסמוך למשטח הגלילי עם הציר שלה לאורך קווי שדה המגנטיים כדי למגנט אותו axially. fiel המגנטית עודףד של סטנט נמצא להיות יציב לפחות 24 שעות, אבל להשתמש בתומכן בהקדם האפשרי לאחר מגנוט.
3. הר סטנטים בנפרד על mandrels זכוכית ולאחר מכן לטעון mandrels הזכוכית בצ'אק הדיוק של מתקן החיטוט המגנטי. הבדיקה microsensor מגנטית ניתן למקם בדיוק בסמוך לסטנט בלי לגעת במשטח באמצעות XYZ שלבי הרכבה של מתקן החיטוט המגנטי (איור 4).
4. מדוד את הקריאה הבסיסית של microsensor המגנטי רחוק מסטנט ולאחר מכן למדוד את השדה מגנטי שמרה על פני השטח של סטנט על ידי מיצוב הבדיקה באמצעות שלבי XYZ של מתקן החיטוט המגנטי.

4. מחקרים סלולארי לכידה מגנטית

1. תאי קבלת, תיוג עם SPION וצביעה עם צבע פלואורסצנטי
   1. לגזור את תאי האנדותל תולדה (EOC) מהדם היקפי חזירי כפי שתואר ^ב5,7. תרבות בבקבוק T-75 untiמחוברות l כ -80% (5x10 ⁶ ל8x10 ⁶ תאים).
   2. לסנתז SPIONs כמגנטיט 10 ננומטר קוטר (Fe ₃ O ₄₎ הליבה מוקפת 50 פולי העבים ננומטר (לקטית-שיתוף חומצה גליקולית) קליפה (PLGA) כפי שמתואר ^ב8,9.
   3. דגירה EOC נגזר עם SPION בריכוז של 200 מיקרוגרם / מיליליטר של מדיום תרבית תאים במשך 16 שעות ב 37 ^{מעלות צלסיוס}
   4. לשאוב את מדיום תרבית תאים בעדינות. לשטוף בעדינות את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) לבקבוק, נדנדה, וaspirating PBS.
   5. כתם התאים עם צבע ניאון (CM-DiI) המאפשר הדמיה במהלך ניסויים. הדבר נעשה להוראות היצרן על ידי הוספת הצבע עד 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בריכוז של 5 μl / מיליליטר ודוגרים עם התאים למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   6. לשטוף את התאים עם PBS כמו בשלב 4.1.4 ודגירה עם 3 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין- EDTA במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ל להרים את התאים מהבקבוק.
   7. מעבירים את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מיליליטר, הראש מעל עם PBS, ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות כדי ליצור תא גלולה.
   8. להשעות מחדש את התא גלולה ב PBS בריכוז של 1-2x10 ⁶ תאים / מ"ל ומערבבים היטב על ידי pipetting ובמתוך צינור חרוטי מספר פעמים.
2. ב- מבחנת תא
   1. עיצוב לפברק (למשל, 3D דפוס) אבזר פשוט להחזיק את הסטנט רק מעל פני השטח של coverslip זכוכית.
   2. לנטרל סטנט באמצעות degausser אלקטרומגנטית או למגנט סטנט לחלוטין או axially באמצעות מגנט ניאודימיום חזק.
   3. פיפטה EOC כותרת SPION התלוי בPBS לתוך הצלחת המכילה סטנטים שליטת axially ממוגנטים או הפוך ממוגנטים או שאינם ממוגנטים. תמונת סטנטים עם EOC התלוי בPBS מייד לקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

class = "jove_title"> 5. ב- vivo בבעלי חיים לימודים

1. השתלת סטנט
   1. להקיז דם היקפי מ4 חזירי יורקשייר בריאים - במשקל כ 50 קילוגרם - 3 שבועות לפני השתלת תומכן בהתאמה והתרבות EOC כפי שתואר ^ב5,7.
   2. לנהל תרופות נגד טסיות דם מתחילות 3 ימים לפני ניתוח (מ"ג 325 האספירין וקלופידוגרל 75 מ"ג ליום).
   3. ביום השתלת סטנט, להרדים את החזירים עם שריר Telazol, Xylazine, ואטרופין (5 / 2-3 / 0.05 מ"ג / קילוגרם בהתאמה) כאמור בהנחיות טיפול בבעלי החיים ושימוש מוסדיות הישימות.
   4. צנרר ולמקם את החזיר על שאיפה של 1-2.5% הרדמה Isoflurane.
   5. לגלח את אזור צוואר הגחון של החזיר ולנהל את ההליך בתנאים סטריליים כלליים.
   6. שתל 1 ממוגנט ו1 תומכן שאינו ממוגנט לעורק כלילי תקין (RCA) באמצעות טכניקת צנתור סטנדרטית.
      1. Catheterization של בעלי חיים צריכה להתבצע על ידי קרדיולוג התערבותית מאומן. גש לעורק התרדמה תקין עם נדן צרפתי 9.
      2. Cannulate העורקים הכליליים היעד ולהזריק צבע ניגוד עם יוד כדי להשיג תמונות fluoroscopic.
      3. הנח guidewire כלילית סטנדרטית 0.014 אינץ 'בעורק. לקדם את הבלון וסטנט באמצעות חוט מדריך זה ולפרוס את הסטנט בכלי קוטר 3-3.5 מ"מ.
   7. לחסום את זרימת הדם בתוך הפרוקסימלי RCA לסטנטים מושתלים באמצעות מעל בלון החוט ולספק כ 2x10 ⁶ EOC אוטולוגית שכותרתו עם SPION המושעה ב 4 מיליליטר של PBS באמצעות הצנתר המרכזי על פני תקופה 2 דקות.
   8. שחזור זרימת דם לRCA לאחר 2 דקות של חסימה נוספת.
   9. מעבירים את החיה לחדר ההתאוששות ולעקוב מקרוב בעלי החיים עד שהוא חזר להכרה.
   10. תמשיך לנהל תרופות אנטי-טסיות (אספירין 325 מ"ג וקלופידוגרל 75 מ 'ז) לפרסם מבצעי עד הקרבה.
2. explant והיסטולוגיה סטנט
   1. להרדים בעלי החיים 7 ימים לאחר ניתוח על ידי הרדמה הראשונה של בעלי החיים כפי שהוסבר קודם לכן ולאחר מכן לנהל הווריד מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (100 מ"ג / קילוגרם) בהתאם להנחיות טיפול בבעלי החיים ושימוש מוסדיות ישימות.
   2. ניתוח לקצור מגזרי עורקי stented. תקן את עורקי explanted ב 10% חיץ פורמלין למינימום של 30 דקות. השאר את הדגימות במאגר פורמלין לניתוח היסטולוגית נוסף.
   3. למיקור חוץ המדגם הקבוע למתקנים מסוגלים לבצע היסטולוגיה עם סטנטים מתכת. במהלך עיבוד זה, הדגימות להטביע בmethylmethacrylate, מחולק צולב, ונותחו בהיסטולוגיה באמצעות טכניקת הצביעה של מאלורי עם כתם כחול פרוסים לחלקיקי ברזל.

תוצאות

עיצוב סטנט איטרטיבי המבוסס על FEA (איור 1) הראה סטנט שיכול crimp ולהרחיב עם מתח עיקרי של 20% שהוא פחות מ 30% המתח האולטימטיבי. Crimping ובדיקת הרחבה (איור 2) לא הראו שום סימנים של שבר. תמונות של סטנט מעוות הראו הסכם טוב עם עיוותי FEA מחושבים וגם תמונות מיקרוסקופי...

Discussion

פיתחנו סטנט מגנטי שיכול לתפקד כסטנט מתכת חשוף ויכול למשוך תאי האנדותל שכותרת SPION. במחקרים קודמים הכוללים סטנטים מגנטיים, חוקרים השתמשו בסטנטים מצופים ניקל מסחריים וסלילים או משתלב עשויים מחומרים מגנטיים בשל חוסר הזמינות של סטנט פרומגנטי ^5,10-14. גם קבוצות אחרות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation	N/A	Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems	N/A	Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00011674
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon	N/A	N/A	Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems	N/A	Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions	N/A	Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic	N/A	Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian