与人体组织转化为癌症研究工作

摘要

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

摘要

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

引言

医学研究已经从两个人细胞系和动物模型的研究受益匪浅。细胞系允许在系统中更好控制元件，以及使用的细胞从适当的生物体。正与人体细胞，而更具有代表性，提出了这可能是负责健康和疾病机制大大简化快照，因为细胞系可能不概括其它细胞，基质组分，并且可能影响反应¹器官的影响。另一方面，动物模型中，虽然不是完全准确的再现人类疾病和遗传异质性，提供通过允许整个动物系统在大多数型号^2,3输入进一步洞察。

缺点不谈，这两种方法都有其优点和是互补的。然而，主要的目标仍然是研究人类细胞和器官，在一个完整的身体，多器官系统。因此，翻译研究具有德恩在促进人体器官和组织中提取患者的研究中，为了更好地把握机制潜在的疾病了长足的发展。转化型研究提供了研究的治疗和疾病导致的整个身体，在适当的细胞中，从而提供了两全其美的细胞和动物实验^4之间的优势。

转化的研究也并非没有缺陷。从人类患者收获标本，在除去从该主机，立即经受缺血和从它们将被保护，否则其他外部因素。这可能导致应力诱导的分子和遗传变化，并导致偏压在随后的研究。因此，很多努力已投入通过严格的方法提取和处理组织，以最好的保护器官和细胞的完整性对下游的研究^5。重要的是，未来的应用必须紧密选择方法□当考虑˚F处理人样品，如某些方法可能是有害的细胞成分和信号通路，同时保留其他。

对于涉及人体组织的任何研究，监管问题必须得到解决。之后塔斯基吉和贝尔蒙特报告，人们越来越接受了生物医学研究与固有的风险往往造成不可避免的伦理困境⁶有关的事实。需要国家标准被认可和联邦政府创建的机构审查委员会（IRB），以维护正当贝尔蒙特报告的原则（尊重个人，善行，正义）的手段。

任何机构的内部评级法是医生，研究人员和社区成员是谁负责保护研究参与者组成的委员会。它要求自愿同意从生物医学研究研究，所有参与者获得的，而这种同意被记录在FO知情同意书 RM。知情同意过程的目的是提供足够的信息，以一个参与者，从而使一个明智的决定可能会在是否要报名参加学习，还是要继续参加该项。在这方面，知情同意文件必须具有良好的可读性和应该写在，可以很容易理解（ ^第 6至^第 8次级读电平）由目标人群的语言。胁迫或不当影响的可能性必须最小化，并且对象必须给予充分的时间来考虑参与。参与者也必须允许行使其在任何阶段研究的过程中没有点球时撤回同意的权利。自愿知情同意是一个强制性的先决条件的受试者参与研究并且还具有法律效力^7。

按照规定进行保护人类受试者21 CFR 50.25（/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8），研究参与者必须被告知的研究目的，参与这项研究的程序，替代品的参与，该研究所有可预见的风险和不适（不仅包括人身伤害，还可能出现的心理，社会或经济损害，不适或不便），福利社会，可能是为了个人，时间长度的主题，预计参加，联系人的问题的答案，或在研究相关的伤害或紧急情况下，声明，表示参与是自愿的，拒绝参加不会造成任何后果或利益损失，如在常规临床护理的妥协该参与者有权与其有关主体的权利，保密权和退出接收他/她的诊断结果，最后声明该研究在没有任何结果的任何时间。从与会者谁在研究的过程中撤回同意组织标本不应被存入银行，必须立即耗尽。的知情同意的一个或多个元件免除可从IRB获得一些可能实际上不可能没有改变完成到所需的元素或用于研究，其中所需的元素是不适用的研究项目。必须采取非常谨慎，以确保数据的保密性。健康保险流通与责任法案（HIPAA）是防止使用或披露"受保护的健康信息"（PHI）未经参与者书面同意的联邦法律。 PHI包括但不限于传输或维持在任何形式或媒介，并且包括可用于识别个人的^9个字段的健康信息。

通过这项工作，我们的目标是勾勒必须Tissu酒店时，必须遵循协议ë处理 - 包括采购，并存储和强调以下这些严格的准则，以便尽量减少可能导致由于在提取的组织受到的应力的偏差的重要性。我们也将尽力提供下游分析或分析（ 图1）可以在这样的标本进行的简要介绍，使读者可以做出最适合他们需要什么样测定（S）合格的判断。

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研究方案

伦理声明:本协议经得克萨斯大学MD安德森癌症中心的大学。

1.样品采购

1. 集研究组织样本的剩余肿瘤及相关正常组织^10-12。在湿冰储存标本，以避免自溶。
2. 发送所有的组织中，医疗器械和外科手术来病理学系为必要的检查过程中被除去的异物，以促进一个病理诊断。
3. 处理时要遵守适用的研究和组织银行的政策和程序分配的研究组织。
   注:生物样本收集涉及病理学家的协调，病理学家"助理，histotechnologists和组织采购专家。

2.病理质量保证（QA）

1. 完成并验证病历作为早期的质量保证措施，并咨询病理学家审查诊断PAtient记录（病理报告，组织切片等）和组织样品。判断组织样品上的感兴趣的形态特征，例如肿瘤的百分比，坏死，组织肿瘤界面等，这是按照biorepository最佳做法^10-12
2. 在初步审查，进行biorepository数据和研究样本进行定期审查逗留生物样本的整个长度中。
3. 从组织病理学和其他调查的样本链接结果和说明，并通过一个专有biorepository软件系统提供该数据给研究者。
   注:QA流程确保双方的临床和技术biorepository操作的各方面的完整性。
4. 执行的遗传和分子测试以验证和表征样品供临床使用。
5. 收集和分析的基础上反馈的研究人员一直在使用的样本进行实验室实验，谁的数据。跟踪采用条形码技术的样品。这种电子跟踪系统也主张在biorespository最佳实践^10-12。

3.标本/组织处理

1. 总是存储新鲜组织标本在湿冰上，并且过程尽可能快，以便限制致萃取自其天然环境中的组织样本的变化。流程正常肿瘤匹配和肿瘤组织标本分别以避免交叉污染。
   注意:基于研究方案，生物试样的处理可以涉及收集试样中的一种或多种类型的媒体。
2. 在开始的过程中，制备无菌的陪替氏培养皿中，手术刀，以及针或镊子用于组织处理。确保管已经制备，标记，并以限制样本处理（图2）的时间敷设。
3. 所有相关的组织的信息，例如患者姓名，号码，治疗，日手术，因为可能适用于研究其他相关信息，应在机构组织的数据库容易接近。有限的患者信息应以书面或电子表格的形式实验室举行。
   注意:只收集相关的研究即性质生物样本信息，基础生物医学研究，临床研究，转化研究等。对于疾病的具体信息，该biorepository人员应收集必要由当前文献资料和管理组织确保正确的诊断和有意义的研究。这包括但不限于肿瘤等级和癌症分段信息。
4. 打算所有期望的后续实验预先决定的需要为每个类型的分析，以及切除的位置的组织切片的尺寸。理想的情况下，虽然不可能的，所有的分析应代表整个组织切片以占组织heterogeneiTY和下游分析的极限偏差。铺陈所有必需项目提前，如图2中所描绘 。
5. 将组织标本在开放的Petri培养皿，平贴在表面上。
   注:仅允许授权biorepository人员处理鉴定样本，并审查确定的健康数据。调查人员应该只访问所允许的签署知情同意书，并作为监管的IRB的患者标识。所有标本必须充分标记的，并应包括在最低限度，以独特的组织的识别号码和组织类型。不包括任何的PHI在标签中，按照HIPAA法规。
6. 从各个角度检查样本，以更好地了解它的结构和尺寸。引脚的样品与针盘的底部，并继续沿平分其最大和最佳代表轴的组织。
7. 切出一小块组织，并将其放置在无菌1.5毫升MICRocentrifuge管含有RNA稳定溶液1ml。该样品可以被放置在冰上的过程的其余部分，并储存在4℃下直到需要。
   注意:当用RNA工作，手套应该总是被磨损，和无RNA酶的过滤嘴应当用于限制降解和RNA污染的机会。
8. 布置在陪替氏培养皿的盖子开放与预先标记的活检盒。切出组织的切片不大于3较厚，以5毫米，并将其转移到盒。放置在10％的盒中性缓冲的福尔马林（NBF）最少72小时的。石蜡包埋之前转移在70％乙醇盒用于长期贮存。
   注意:标记盒的应用铅笔或与推荐标记作使用二甲苯的处理过程中，否则将擦除标签进行。
9. 切出一块组织的，并放置在组织模具。盖在最佳切割温度（OCT）化合物中的组织切片，并立即冻结其在-20℃下cryosectioning。本组织切片可被存储在-20℃，直到准备cryosectioning。
10. 切出的一个或多个组织片，并将它们转移到一个50ml管中含有的MACS缓冲液（1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.5％胎牛血清（FBS），2mM的乙二胺四乙酸（EDTA）），用于后续的流式细胞分析。对于流式细胞术，较大的样品可优选作为细胞可以在肿瘤解离，细胞固定和透化需要时会丢失。一般地，此部分可采取在最后，一旦所有其他部分都已经被处理。剩的代表性肿瘤样品可以用于流式细胞仪。任选地，该管可以被存储在4℃的CO / N或用于流式细胞染色后立即消化成细胞悬浮液（见步骤4 - 流式细胞染色）。
11. 切割组织的剩余部分成片不大于0.5毫米×0.5毫米的最大尺寸，并将它们传送到低温小瓶在液氮立即冻结。这些快速冷冻样品可以用于未来的分析和合作目的。
    注:应加倍小心用液氮工作时的直接接触可引起严重的伤害服用。眼睛应该被保护，安全眼镜带有侧面防护或防护面罩。低温手套也应佩戴液氮烧伤引起的飞溅和直接接触保护。手套应正确佩戴，但宽松，足以迅速取出应液氮溅入其中。

4.流式细胞仪染色

1. 组织均匀化
   1. 准备用DMEM（40毫升），DNA酶I（50U / ml）和胶原酶I（2毫克/毫升）消化培养基。将在MACS缓冲新鲜或O / N存储肿瘤在培养皿的盖子，并淹没消化中。
      注:不同的消化方法都存在，各具优势（ 即细胞表面蛋白的前PRESSION，活力）。确保你有你想要的下游应用的正确方法。
   2. 销肿瘤用针盘的底部，并从外部切割用手术刀居中，直到肿瘤具有糊状的质地。转移瘤组合，以50毫升管，密封并放在一个塑料袋，以防止泄漏。转移管至孵化器，并旋转以225RPM，37℃，1小时。
   3. 通过一个70微米的细胞过滤器过滤肿瘤细胞悬浮液。离心细胞悬浮液在250×g离心，4℃，5分钟。悬浮细胞沉淀在1ml FACS缓冲液（500毫升PBS中，加入1ml的0.5M EDTA的库存，将10毫升的FCS或FBS）。
   4. 使用血球计数细胞并重新悬浮于1×10 ^7个细胞/ ml的浓度。转移每孔^100μl（10 6个细胞）在96孔圆底板进行染色。
2. 活力和抗体染色
   1. 加入200μl的生存能力染色液向每个孔并混合。 INCU软化30分钟，在4℃下，在黑暗中。降速细胞在250×g离心，4℃，5分钟，并吸出上清。
   2. 在推荐/滴定浓度（根据制造商），用于在200μlFACS缓冲液表面抗原添加抗体混合物。孵育细胞，在4℃，30分钟，在黑暗中。降速细胞在250×g离心，4℃，5分钟，并吸出上清。
   3. 用200微升FACS缓冲液洗，降速细胞在250 XG，4℃，5分钟，吸出上清液。悬浮细胞在200微升FACS缓冲液，并继续流式细胞仪进行采集和分析。
      注:如果进行细胞内流式细胞染色，执行步骤4.2.2和4.2.3之间的固定和通透步骤和细胞内染色。如果执行因子染色，细胞应是预活化前染色的建议，并应活化过程中使用的细胞内蛋白质转运和分泌如莫能菌素的抑制剂确保保留的可溶性因子。固定的细胞可以被存储短期（一周），在4℃在黑暗中之前采集上的流式细胞仪。

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结果

下面显示的结果描绘流式细胞仪门控策略，在处理黑色素瘤广泛的免疫表型。染色的天，组织样品在225 RPM转动消化且用胶原酶I和DNA酶I温育60分钟，在37℃下。以下消化，细胞悬浮液通过70μm的细胞过滤滤波，以消除碎片和细胞用流式细胞仪抗体免疫细胞表型荧光标记流动。下面（图3）示出的是在MACS缓冲门控策略和染色对组织存储的O / N多个标记在4℃。如图所示，标本在4℃处理?...

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讨论

最终，处理的方法必须由所需的假说的支配和预期的技术测定，以进行（ 图1）。以下部分作为概述来描述可在这样的组织切片进行电位测定法。这决不是一个详尽的概述，但旨在帮助指导来样加工方法和选择下行测定所描述的技术，并列出他们的长处和短处。

流式细胞术染色可以执行上新鲜解剖组织切片，或片段存储的O / N的MACS缓冲液中于4℃。流式细胞仪便于...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957