Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Riepilogo

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Abstract

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Introduzione

La ricerca medica ha beneficiato immensamente dallo studio di entrambe le linee cellulari umane e modelli animali. Linee cellulari consentono un migliore controllo dei componenti in un sistema, così come l'uso di cellule dalla corretta organismo. Lavorare con le cellule umane, mentre più rappresentativo, presenta un'istantanea drasticamente semplificata di meccanismi che potrebbero essere responsabili per la salute e la malattia, perché le linee di cellule non potrebbero riassumere l'impatto di altre cellule, componenti stromali e gli organi che possono influenzare le risposte ^1. D'altra parte, i modelli animali, anche se non del tutto accurata nel riprodurre malattie umane e eterogeneità genetica, offrono ulteriore comprensione, consentendo per l'introduzione di sistemi animali interi nella maggior parte dei modelli ^2,3.

Carenze a parte, entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e sono complementari. Tuttavia, l'obiettivo principale rimane per studiare le cellule e organi umani, in un corpo pieno, sistema multi-organo. Di conseguenza, la ricerca traslazionale ha takit grandi passi avanti nel facilitare lo studio di organi e tessuti umani estratti da pazienti, al fine di cogliere meglio i meccanismi della malattia di base. Ricerca traslazionale offre il vantaggio di studiare il risultato di trattamenti e malattie in tutto il corpo e in cellule opportune, fornendo in tal modo il meglio dei due mondi tra cellula animale e ^di lavoro 4.

Ricerca traslazionale inoltre, non è esente da difetti. Campioni raccolti da pazienti umani, dopo la rimozione dal padrone di casa, sono immediatamente sottoposti a ischemia e altri fattori esterni, da cui sarebbero stati altrimenti protetti. Ciò può causare cambiamenti molecolari e genetiche indotte dallo stress, e causare pregiudizi in studi successivi. Pertanto, molto sforzo è stato messo in estrarre e trattare i tessuti con metodi rigorosi per conservare meglio organo e l'integrità delle cellule per gli studi a valle ^5. È importante sottolineare che le future applicazioni devono essere considerate attentamente quando si seleziona i metodi of elaborazione campioni umani, come certi metodi possono essere dannosa per i componenti cellulari e vie di segnalazione, risparmiando altri.

Per ogni ricerca che coinvolge i tessuti umani, questioni normative devono essere affrontate. Dopo le relazioni di Tuskegee e Belmont, c'è stata una crescente accettazione del fatto che la ricerca biomedica è risultato associato a rischi spesso con conseguente dilemmi etici inevitabili ^6. La necessità di norme nazionali è stata riconosciuta e il governo federale ha creato Institutional Review Boards (IRB) come un mezzo per sostenere i principi del Rapporto Belmont (rispetto delle persone, la beneficenza, la giustizia).

IRB di ogni istituzione è un comitato di medici, ricercatori e membri della comunità che sono responsabili per la protezione dei partecipanti alla ricerca. Si richiede che il consenso volontario presso tutti i partecipanti di studi di ricerca biomedica, e che tale consenso documentato in un consenso informato fo rm. Il processo di consenso informato si propone di fornire informazioni adeguate a un partecipante, in modo che una decisione informata può essere fatta o meno di iscriversi in uno studio, o di continuare la partecipazione. A questo proposito, il documento di consenso informato deve avere una buona leggibilità e dovrebbe essere scritto in un linguaggio che può essere facilmente compreso (6 ^all'8 livello di lettura grado) da parte della popolazione bersaglio. La possibilità di coercizione o indebito condizionamento deve essere ridotto al minimo, e il soggetto deve essere dato tempo sufficiente per prendere in considerazione la partecipazione. Il partecipante deve essere consentito di esercitare il diritto di revocare il consenso in qualsiasi momento durante il corso dello studio senza penalità. Consenso informato volontario è un pre-requisito obbligatorio per la partecipazione di un soggetto nel campo della ricerca ed è anche giuridicamente efficace ^7.

Come da regolamento per la protezione dei diritti umani assoggetta 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8), partecipanti allo studio devono essere informati dello scopo della ricerca, le procedure coinvolti nella ricerca, alternative alla partecipazione, tutti i rischi prevedibili e disagi (tra cui non solo danni fisici, ma anche possibile danni psicologici, sociali o economiche, disagio o disagio), i benefici della ricerca per la società e, eventualmente, per l'individuo, tempo in cui il soggetto si aspetta di partecipare, persona da contattare per le risposte alle domande o in caso di un infortunio connesse alla ricerca o di emergenza, dichiarazione che indichi che la partecipazione è volontaria e che il rifiuto di partecipare non comporterà alcuna conseguenza o qualsiasi perdita di benefici, come un compromesso in una regolare cura clinica che il partecipante ha comunque diritto a ricevere come risultato dei suoi / sue diagnosi, e, infine, una dichiarazione per quanto riguarda il diritto del soggetto alla riservatezza e diritto di recedere dalstudio in qualsiasi momento senza conseguenze. I campioni di tessuto da partecipanti che si ritirano consenso nel corso dello studio non devono essere inclinate e devono essere immediatamente esauriti. Rinuncia di uno o più elementi di consenso informato possono essere ottenute presso la IRB per alcuni progetti di ricerca che non possono praticamente essere fatto senza una modifica gli elementi necessari o per studi in cui gli elementi richiesti non sono applicabili. Grande cura deve essere presa per garantire la riservatezza dei dati. La Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) è una legge federale che impedisce di utilizzo o la divulgazione "Protected Health Information" (PHI) senza il consenso scritto da parte dei partecipanti. PHI include ma non si limita alle informazioni sulla salute trasmesse o mantenuti in qualsiasi forma o mezzo e comprende campi che potrebbero essere utilizzate per identificare un individuo ^9.

Attraverso questo lavoro, ci proponiamo di delineare il protocollo da seguire durante tissue trattamento - compresi gli appalti, e lo stoccaggio e sottolineano l'importanza di queste linee guida rigorose seguente, in modo da ridurre al minimo le distorsioni che possono derivare a causa delle sollecitazioni un tessuto è sottoposto al momento dell'estrazione. Abbiamo anche sforziamo di fornire una breve panoramica dei saggi a valle o analisi (Figura 1) che possono essere eseguite su tali esemplari modo che i lettori possano esprimere un giudizio qualificato su quale dosaggio (s) più adatta alle loro esigenze.

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Protocollo

Dichiarazione Etica: Questo protocollo è approvato dalla University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. Procurement campioni

1. Raccogliere campioni di tessuto tumorale ricerca da surplus e relativo tessuto normale ^10-12. Conservare i campioni sul ghiaccio bagnato per evitare autolisi.
2. Invia tutti i tessuti, dispositivi medici e corpi estranei rimossi durante una procedura chirurgica per il Dipartimento di Patologia all'esame necessario per facilitare una diagnosi patologica.
3. Maniglia tessuto assegnato per la ricerca in conformità con la ricerca applicabili e le politiche bancarie dei tessuti e delle procedure.
   NOTA: collezione Biospecimen richiede un coordinamento delle patologi, patologi 'assistenti, histotechnologists e specialisti di approvvigionamento dei tessuti.

2. Patologia Quality Assurance (QA)

1. Completare e verificare i dati dei pazienti come misura QA precoce e consultare un patologo a rivedere pa diagnosticorecord di degenza per (rapporti di patologia, scivoli di tessuto, ecc) e campioni di tessuto. Campioni di tessuto giudice caratteristiche morfologiche di interesse come la percentuale di tumori, necrosi, l'interfaccia del tessuto tumorale, ecc Questo è in linea con le best practice biorepository ^10-12.
2. A seguito di revisione iniziale, condurre revisioni periodiche dei dati biorepository e campioni di ricerca durante l'intera durata del soggiorno dei biospecimen.
3. Risultati di link e annotazioni di istopatologici e altre indagini ai campioni e fornire questi dati ai ricercatori attraverso un sistema di software biorepository proprietario.
   NOTA: i processi QA assicurare l'integrità di entrambi gli aspetti clinici e tecnici delle operazioni biorepository.
4. Eseguire i test genetici e molecolari per verificare e caratterizzare i campioni per uso clinico.
5. Raccogliere e analizzare i dati in base al feedback da parte dei ricercatori che hanno utilizzato i campioni per esperimenti di laboratorio. Tracciacampioni che utilizzano la tecnologia del codice a barre. Questo sistema di monitoraggio elettronico è anche sostenuto in best practice biorespository ^10-12.

3. campioni / Tissue Processing

1. Conservare sempre campioni di tessuto fresco in ghiaccio, e procedimenti più rapidamente possibile, al fine di limitare i cambiamenti indotti da estrazione del campione di tessuto dal suo ambiente naturale. Processo normale tumore abbinato e campioni di tessuto tumorale separatamente per evitare la contaminazione incrociata.
   NOTA: In base a protocolli di ricerca, elaborazione biospecimen può comportare la raccolta di esemplari in uno o più tipi di media.
2. Prima di iniziare il processo, preparare una piastra di Petri sterile cultura, un bisturi, così come un ago o pinze per la lavorazione del tessuto. Accertarsi che i tubi sono stati preparati, etichettati, e disposti al fine di limitare il tempo di trattamento del campione (Figura 2).
3. Tutte le informazioni pertinenti dei tessuti, come ad esempio il nome del paziente, il numero, il trattamento, la data dichirurgia, e altre informazioni pertinenti come può essere adatto per lo studio, dovrebbero essere resi facilmente accessibili in un database del tessuto istituzionale. Informazioni per il paziente limitata dovrebbe essere tenuto in laboratorio in formato cartaceo o foglio di calcolo.
   NOTA:. Raccogliere solo le informazioni biospecimen pertinenti alla natura del cioè ricerca, la ricerca di base biomedica, la ricerca clinica, la ricerca traslazionale, ecc Per informazioni malattia-specifica, il personale biorepository dovrebbe raccogliere dati ritenuti necessari per la letteratura e le organizzazioni che governano a assicurare una corretta diagnosi e la ricerca di significato. Questo include ma non si limita ai gradi tumorali e cancro informazioni stadiazione.
4. Piano tutti gli esperimenti successivi desiderati in anticipo, per decidere la dimensione delle sezioni di tessuto necessari per ogni tipo di analisi, così come la posizione di escissioni. Idealmente, anche se impossibile, tutte le analisi devono essere rappresentativi di tutta la sezione di tessuto al fine di tenere conto di heterogenei tessutoty e il limite di polarizzazione delle analisi a valle. Disporre tutti gli elementi richiesti in anticipo come illustrato nella Figura 2.
5. Posizionare il campione di tessuto del piatto di coltura di Petri aperta, piatto contro la superficie.
   NOTA: Consenti solo personale autorizzato biorepository per gestire i campioni individuati e per consultare i dati sanitari identificati. Gli investigatori dovrebbero accedere solo quelle identificazione del paziente, come consentito dalle consensi informati firmati e come regolato dalla IRB. Tutti i campioni devono essere adeguatamente etichettati e dovrebbero comprendere come minimo, un numero di identificazione dei tessuti e tessuti tipo unico. Non includere qualsiasi PHI nelle etichette, in conformità alla normativa HIPAA.
6. Controllare il campione da tutti gli angoli, per ottenere una migliore comprensione della struttura e dimensioni. Pin il campione al fondo del piatto con l'ago, e procedere alla bisettrice del tessuto lungo il suo asse maggiore e migliore rappresentante.
7. Tagliare un piccolo pezzo di tessuto e metterlo in una sterile 1,5 ml micrtubo ocentrifuge contenente 1 ml di soluzione-RNA stabilizzante. Questo esempio può essere collocato sul ghiaccio per il resto del processo e conservata a 4 ° C fino al momento dell'uso.
   NOTA: Quando si lavora con l'RNA, guanti deve sempre essere indossato, e puntali con filtro RNasi-free dovrebbe essere usato per limitare le possibilità di degradazione e la contaminazione di RNA.
8. Disporre una cassetta biopsia aperta e pre-marcato nel coperchio del piatto cultura Petri. Tagliare una fettina di tessuto di spessore non superiore a 5 mm 3 e trasferirlo alla cassetta. Mettere la cassetta nel 10% neutra tamponata formalina (NBF) per un minimo di 72 ore. Trasferire la cassetta in etanolo al 70% per l'archiviazione a lungo termine prima di paraffina-embedding.
   NOTA: Labeling di cassette deve essere effettuata a matita o con marcatori raccomandati come uso di xilene durante la lavorazione si altrimenti cancellerà etichette.
9. Tagliare un pezzo di tessuto e metterlo in uno stampo di tessuto. Coprire la sezione di tessuto in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto, e congelare immediatamentea -20 ° C per criosezionamento. Questa sezione di tessuto può essere conservato a -20 ° C fino al momento criosezionamento.
10. Tagliare uno o più pezzi di tessuto e di trasferirli in un tubo da 50 ml contenente tampone MACS (1x tampone fosfato salino (PBS), siero fetale bovino 0,5% (FBS), 2 l'acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA)) per la successiva citometria a flusso di analisi . Per la citometria a flusso, i campioni più grandi possono essere preferibile in quanto le cellule potrebbero essere persi durante dissociazione tumore, la fissazione delle cellule e permeabilizzazione quando richiesto. Generalmente, questa sezione può essere presa alla fine, una volta che tutte le altre parti sono state elaborate. Leftover campione del tumore rappresentante può essere utilizzato per la citometria a flusso. Opzionalmente, questo tubo può essere conservato a 4 ° CO / N o utilizzati per la colorazione di citometria di flusso immediatamente dopo la digestione in una sospensione cellulare (vedere il punto 4 - citometria a flusso colorazione).
11. Tagliare resto del tessuto in pezzi non più grandi di una dimensione massima di 0,5 mm x 0,5 mm e trasferirli criogenicofiale per immediatamente congelati in azoto liquido. Questi campioni a scatto congelati possono essere utilizzati per analisi future e le finalità di collaborazione.
    NOTA: La cura supplementare dovrebbe essere presa quando si lavora con l'azoto liquido come il contatto diretto può provocare gravi lesioni. Gli occhi devono essere protetti con occhiali di sicurezza con protezioni laterali o con una visiera. Guanti criogenici dovrebbero anche essere indossati per proteggere dalle scottature azoto liquido causati da spruzzi e il contatto diretto. I guanti devono misura giusta ma essere abbastanza largo da rimuovere rapidamente dovrebbe azoto liquido spruzzata in loro.

4. citometria a flusso Colorazione

1. Tissue omogeneizzazione
   1. Preparare medio digestione con DMEM (40 ml), DNasi I (50 U / ml) e collagenasi I (2 mg / ml). Luogo fresco o tumore O / N-memorizzato in tampone MACS nel coperchio di una piastra di Petri e sommergere con mezzo di digestione.
      NOTA:. Esistono diversi metodi di digestione, ciascuno con vantaggi (per esempio, superficie cellulare proteina expressione, vitalità). Assicurarsi di avere il metodo corretto per l'applicazione a valle desiderata.
   2. Tumore bottone al fondo del piatto con un ago, e taglio dall'esterno per centrare con un bisturi, fino a quando il tumore ha una consistenza pastosa. Trasferimento mix tumore ad un tubo da 50 ml, sigillo e mettere in un sacchetto di plastica per evitare perdite. Trasferire tubo un'incubatrice, e ruotare a 225 RPM, 37 ° C, 1 ora.
   3. Filtro sospensione delle cellule tumorali attraverso un colino cellula 70μm. Sospensione cellulare a 250 xg Centrifugare, 4 ° C, 5 min. Risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone di FACS (500 ml di PBS, 1 ml di 0,5 m stock EDTA, 10 ml FCS o FBS).
   4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere alla concentrazione di 1x10 ⁷ cellule / ml. Trasferire 100 microlitri per pozzetto (10 ⁶ celle) in una piastra di fondo pozzo rotondo 96 per la colorazione.
2. Viabilità e anticorpi colorazione
   1. Aggiungere 200 ml di soluzione colorante vitalità in ogni pozzetto e mescolare. Incubate per 30 minuti, a 4 ° C, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante.
   2. Aggiungi miscela di anticorpi a raccomandato / concentrazione titolato (secondo produttore) per antigeni di superficie in 200 ml di tampone FACS. Incubare le cellule a 4 ° C, 30 min, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante.
   3. Lavare con 200 ml di tampone FACS, centrifugare le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di FACS e procedere al citofluorimetro per l'acquisizione e l'analisi.
      NOTA: Se si effettuano intracellulare citometria a flusso colorazione, eseguire fissazione e passi permeabilizzazione e colorazione intracellulare tra i passaggi 4.2.2 e 4.2.3. Se si esegue citochine colorazione, le cellule devono essere pre-attivato colorazione precedente come raccomandato, e un inibitore del trasporto della proteina intracellulare e la secrezione quali monensin dovrebbero essere utilizzati durante l'attivazione perassicurare il mantenimento di fattori solubili. Cellule fisse possono essere conservate a breve termine (una settimana) a 4 ° C al buio prima di acquisizione su un citometro a flusso.

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Risultati

I risultati visualizzati rappresentano il flusso di strategia citometria gating per un'ampia fenotipizzazione immunitario un tumore melanoma trattati. Il giorno di colorazione, campione di tessuto è stato digerito con collagenasi e omogeneizzato I e DNasi I incubazione per 60 min a 37 ° C sotto 225 rotazione RPM. A seguito di digestione, sospensione cellulare è stata filtrata attraverso un colino cella 70 micron per eliminare i detriti e le cellule sono state colorate con il flusso di fluorescenza marcata c...

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Discussione

Infine, i metodi di lavorazione devono essere dettate dalla ipotesi desiderata e previsti saggi tecnici da eseguire (Figura 1). La sezione seguente serve come una panoramica di descrivere eventuali saggi che possono essere eseguite su tali sezioni di tessuto. E non è affatto un quadro esaustivo, ma ha lo scopo di aiutare i metodi di lavorazione campione di guida e scelta di saggi a valle con tecniche descrivere ed elencare i loro punti di forza e di debolezza.

Citometria a ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957