トランスレーショナルがん研究のためのヒト組織での作業

要約

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

要約

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

概要

医学研究は、ヒト細胞株および動物モデルの両方の研究から非常に恩恵を受けています。細胞株は、より良いシステムのコンポーネントの制御、ならびに適切な生物からの細胞の使用を可能にします。ヒト細胞での作業、より多くの代表が、細胞株は^、1応答に影響を与える可能性があり、他の細胞、間質コンポーネント、および臓器の影響を再現いない可能性があるため、健康と病気の原因である可能性が大幅に簡素化メカニズムのスナップショットを提供します。一方、動物モデルは、ヒトの疾患および遺伝的異質性を再現することに完全に正確ではないが、ほとんどのモデル^2,3全体動物系の入力を可能にすることによってさらなる洞察を提供しています。

欠点はさておき、両方の方法は、その利点を持っており、相補的です。しかし、主な目標は、完全体、多臓器系において、ヒト細胞や臓器を研究するために残っています。したがって、トランスレーショナルリサーチは、TAKがありますより良い疾患の根底にあるメカニズムを把握するために、患者から抽出された人間の臓器や組織の研究を促進する上で大きな進歩が備わっています。トランスレーショナル研究は、それによって細胞と動物の^ワーク 4の間の両方の長所を提供し、体全体に、適切な細胞に治療や病気の結果を研究する利点を提供しています。

トランスレーショナル研究は欠陥なしでもありません。ヒト患者から採取した試料は、ホストから除去すると、直ちに虚血、それらが他の方法で保護されるであろう、他の外部要因にさらされます。これは、ストレス誘発性分子および遺伝的変化をもたらし、そしてその後の研究に偏りが発生することがあります。そのため、多くの努力が最高の下流の研究⁵のために臓器や細胞の完全性を維持するために厳格な方法により抽出して処理する組織に置かれています。方法を選択する際に重要なことは、将来のアプリケーションは、O密接に検討する必要がありますF特定の方法は細胞成分に有害であり得るように、人間のサンプルを処理し、他の人を温存しながら、シグナル伝達経路。

ヒト組織を含む任意の研究のために、規制の問題に対処しなければなりません。タスキーギ、ベルモント報告した後、生物医学研究は、内在するリスクは、多くの場合、避けられない倫理的ジレンマ⁶の結果と関連していたという事実を受け入れ成長がありました。国の基準の必要性が認識され、連邦政府はベルモントレポート（人の尊重、善行、正義）の原則を守るための手段としての制度審査委員会（のIRB）を作成しました。

どれ機関のIRBは、研究参加者の保護を担当している医師、研究者、コミュニティメンバーの委員会です。これは自発的な同意が生物医学研究の研究のすべての参加者から取得されることを必要とし、この同意は、インフォームドコンセントFOに記載されていること RM。インフォームドコンセントのプロセスに通知決定は研究に登録する、または参加を継続するか否かで行うことができるように、参加者に適切な情報を提供することを目的とします。この点では、インフォームドコンセント文書は良い読みやすさを持っている必要があり、容易に標的集団によって（8 ^{番目のグレードの}読書レベルに6 ^番目）を把握することができる言語で記述する必要があります。強制や不適切な影響の可能性を最小限に抑えることが必要であり、被験者は、参加を検討する十分な時間を与えなければなりません。参加者はまた、ペナルティなしで研究の過程でいずれかの段階で同意を撤回する権利を行使することが許されなければなりません。自主インフォームドコンセントは、研究中の被験者の参加のための必須の前提条件であり、それはまた^、7法的に有効です。

ヒト被験者の保護21 CFR 50.25（規程に従って/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8）、研究参加者は、研究の目的の研究に関わる手順を通知する必要があり、参加への代替、社会に、おそらく個々の研究のすべての予見可能なリスクと不快感（だけでなく、物理的損傷だけでなく、可能な、心理的、社会的、または経済的損害、不快感、または不便を含む）、利益、対象が参加することを期待されている時間の長さ、質問への回答、または研究に関連した傷害や緊急時に連絡する人、文の参加は任意であり、参加することを拒否がいかなる結果にはなりませんか、そのような定期的な臨床ケアにおける妥協として利益の損失ことを示します参加者はそうでなければ彼/彼女の診断の結果として受け取る権利を有する、と最終的に撤退する機密性と権利の対象者の権利に関する記述されていますいかなる結果なしで、いつでも勉強。研究の過程で同意を撤回参加者から組織標本をバンクされるべきではないとすぐに排出される必要があります。インフォームドコンセントの1つ以上の要素の権利放棄は、実際に必要な要素を変更せずに、または必要な要素が適用されない研究のために行うことができませんでしたいくつかの研究プロジェクトのためにIRBから得ることができます。細心の注意は、データの機密性を確保するために注意する必要があります。医療保険の携行性と責任に関する法律（HIPAA）は、参加者からの書面による同意なしに「保護された健康情報」（PHI）を使用して、または開示阻止する連邦法です。 PHIを含むが、健康情報送信又は維持する任意の形態または媒体中で、個々の^{9を同定するために}使用することができるフィールドを含むに限定されるものではありません。

この作品を通じ、我々はTISSU中に従わなければならないプロトコルの概要を説明することを目指してe処理 - 調達を含め、ストレージとは、組織は、抽出の際に供されるストレスに起因する可能性がありバイアスを最小にするように、これらの厳格なガイドラインに従うことの重要性を強調する。また、読者は、最高の自分のニーズに合ったものをアッセイ（複数可）に適格判定を行うことができるように、このような試験片で実施することができる下流のアッセイまたは分析の概要（ 図1）を提供するために努めています。

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プロトコル

倫理の声明：このプロトコルは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターによって承認されています。

1.標本調達

1. 余剰腫瘍と関連する正常組織^10-12から研究組織サンプルを収集します。ストアは自己分解を避けるために、濡れた氷の上に標本。
2. 病理学的診断を容易にするために必要な検査のために病理学部に全ての組織、医療機器、外科的処置の間に除去異物を送信します。
3. 該当する研究組織バンキング方針及び手続に従って研究のために割り当てられた組織を処理します。
   注：生物試料の収集は、病理医、病理医「アシスタント、histotechnologistsおよび組織の調達の専門家の連携を必要とします。

2.病理品質保証（QA）

1. 完了し、初期のQA措置として患者の記録を確認し、診断PAを確認する病理医にご相談くださいtientレコード（病理報告、組織スライド、等）と組織サンプル。これは、バイオレポジトリーのベストプラクティス^10〜12に従うものであるなど、腫瘍の割合、壊死、組織腫瘍インターフェース、など関心の形態的特徴の裁判官の組織サンプル。
2. 最初のレビューに続いて、生物試料の滞在の全体の長さの間、バイオレポジトリーデータと研究サンプルの定期的なレビューを実施しています。
3. サンプルに組織病理学的およびその他の調査からのリンクの結果と注釈と独自のバイオレポジトリー・ソフトウェア・システムを介して研究者にこのデータを提供します。
   注：QAプロセスはバイオレポジトリー操作の臨床的および技術的側面の両方の整合性を確保します。
4. 臨床使用のためのサンプルを確認し、特徴づけるための遺伝的および分子テストを実行します。
5. 実験室での実験のためのサンプルを使用している研究者からのフィードバックに基づいてデータを収集し、分析します。トラックバーコード技術を使用してサンプル。この電子追跡システムもbiorespositoryベストプラクティス^10-12に提唱されています。

3.試料/組織処理

1. 常にその自然環境からの組織サンプルを抽出することによって誘導される変化を制限するために、可能な限り迅速に新鮮な組織の湿った氷の上の標本、およびプロセスを格納します。別々に交差汚染を回避するためにプロセスの正常腫瘍一致および腫瘍組織サンプル。
   注：研究プロトコルに基づいて、生物試料の処理は、媒体の一つ以上の種類の標本の収集を含むことができます。
2. プロセスを開始する前に、滅菌ペトリシャーレ、メス、ならびに組織処理用の針や鉗子を用意。チューブは、調製した標識、およびサンプル処理（ 図2）の時間を制限するためにレイアウトされていることを確認してください。
3. そのような患者の名前、番号、治療の日などすべての関連組織情報、手術、および研究のために適切であるかもしれないように、他の関連情報は、制度的組織データベースに容易にアクセスできるようにする必要があります。リミテッド患者情報は、紙やスプレッドシート形式でラボで開催される必要があります。
   注：のみの研究すなわちの性質に関連する生物試料情報を収集し、基礎生物医学研究、臨床研究、トランスレーショナルリサーチなど疾患固有の情報については、バイオレポジトリーのスタッフがデータを収集する必要があり、現在の文献が必要と認めたとする組織を支配します適切な診断と意味のある研究を保証します。これは、しかし、腫瘍のグレードと癌ステージング情報に限定されるものではありません。
4. 分析の種類ごとに必要な組織切片の大きさだけでなく、切除の位置を決定するために、事前に必要なすべてのその後の実験を計画します。不可能ものの理想的には、すべての分析は、組織heterogeneiを考慮するために全体の組織切片の代表であるべきTYと下流の分析の限界バイアス。 図2に示すように、事前に必要なすべての項目をレイアウトします。
5. 表面に対してフラット、オープンペトリ培養皿で組織標本を置きます。
   注：のみ許可バイオレポジトリーのスタッフが特定のサンプルを処理し、識別された健康データを確認することを許可します。研究者は、IRBによって規制として署名知らさ同意によって許可されたとしてのみ患者識別子にアクセスする必要があります。すべての標本は適切にラベル付けされなければならず、最小限の、ユニークな組織の識別番号と組織型に含める必要があります。 HIPAAの規制に従って、ラベル内の任意のPHIを含めないでください。
6. その構造及び寸法のより良い理解を得るために、あらゆる角度からサンプルを検査します。針で皿の底にサンプルをピン、およびその最大かつ最高の代表軸に沿って組織を二分に進みます。
7. 組織の小片を切り出し、滅菌1.5ミリリットルMICRに置きますRNA-安定化溶液の1ミリリットルを含むocentrifugeチューブ。このサンプルは、プロセスの残りのために氷上に置き、必要になるまで4℃で保存することができます。
   注：RNAを用いて作業する場合、手袋を常に着用しなければならない、RNaseフリーフィルターチップが劣化し、RNA汚染の可能性を制限するために使用されるべきです。
8. ペトリ培養皿の蓋でオープンし、予め標識バイオプシーカセットをレイアウトします。 3〜5ミリを超えない厚い組織の切片を切り出し、カセットに転送します。 72時間の最低10％中性緩衝ホルマリン（NBF）にカセットを置きます。パラフィン包埋前に長期保存のために70％エタノール中にカセットを転送します。
   注：カセットの標識は鉛筆またはそれ以外のラベルが消去され、処理中のキシレンの使用として推奨マーカーを用いて行われるべきです。
9. 組織片を切り出し、組織型に配置します。最適な切削温度（OCT）化合物中の組織切片をカバーして、すぐにそれを凍結凍結切片のために-20℃で。この組織切片は、凍結切片のための準備ができるまで-20℃で保存することができます。
10. 一つまたは組織の多くの部分を切り取り、サイトメトリー分析、その後の流れのためのMACS緩衝液（1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、0.5％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA））を含む50 mlチューブに移します。必要な場合に、細胞が腫瘍解離、細胞の固定及び透過化の間に失われることがあるように、フローサイトメトリーのために、より大きなサンプルは好ましいかもしれません。すべての他の部分が処理された後、一般的に、このセクションでは、終了時に採取することができます。残りの代表的な腫瘍サンプルは、フローサイトメトリーのために使用することができます。任意に、このチューブはすぐに（ - フローサイトメトリー染色手順4を参照）を細胞懸濁液に消化後、4℃で保存したCO / Nまたはフローサイトメトリー染色のために使用することができます。
11. X 0.5ミリメートル0.5ミリメートルの最大サイズよりも大きくない片に組織の残りの部分をカットし、極低温に転送液体窒素中で即時凍結用バイアル。これらの急速凍結サンプルを、将来の分析との共同の目的のために使用することができます。
    注：直接の接触は深刻な怪我の原因となりますので、液体窒素を用いて作業する場合余分な注意が必要です。目はサイドシールド付きまたはフェイスシールド付き安全メガネを保護する必要があります。極低温の手袋も飛散し、直接接触による液体窒素火傷から保護するために着用する必要があります。手袋は適切にフィットしますが、それらにすべき液体窒素スプラッシュ速やかに除去されるのに十分緩んでなければなりません。

4.フローサイトメトリー染色

1. 組織均質化
   1. DMEM（40ミリリットル）、DNアーゼI（50 U / ml）およびコラゲナーゼI（2 mg / mlの）での消化培地を準備します。ペトリ皿の蓋にMACSバッファーに新鮮またはO / Nに格納された腫瘍を置き、消化培地に沈めます。
      注：異なる消化方法は、存在する利点は、各（ すなわち 、細胞表面タンパク質の元PRESSION、生存能力）。ご希望の下流アプリケーションのための適切な方法があることを確認します。
   2. ピン針で皿の底に腫瘍、及び腫瘍がペースト状の組織を有するまで、メスで中央に外側からカット。リークを避けるために、ビニール袋に50mlのチューブ、シールと場所に腫瘍ミックスを転送します。インキュベーターにチューブを移し、225rpmで回転させ、37°C​​、1時間。
   3. 70μmのセルストレーナーを介して腫瘍細胞懸濁液をフィルタリングします。 250×gで、4℃、5分で遠心細胞懸濁​​液。 1ミリリットルのFACS緩衝液（500ミリリットルのPBS、1ミリリットルの0.5MストックEDTA、10ミリリットルのFCSまたはFBS）中に再懸濁細胞ペレット。
   4. 血球計数器を用いて細胞を計数し、1×10 ⁷細胞/ mlの濃度で再懸濁します。転送染色のための96ウェル丸底プレート中のウェルあたり100μlの（10 ^6細胞 ）。
2. 生存率および抗体染色
   1. 各ウェルに生存能力染色溶液200μlを加えて混合します。 Incu暗所で4℃で30分間譲り、。 250×gで、4℃、5分、および吸引上清で細胞をスピンダウン。
   2. FACS緩衝液200μl中表面抗原に（メーカーによる）推奨/滴定濃度の抗体の混合物を追加します。暗所で、4℃、30分で細胞をインキュベートします。 250×gで、4℃、5分、および吸引上清で細胞をスピンダウン。
   3. 、FACS緩衝液200μlで洗浄し250 xgで細胞をスピンダウンし、4℃、5分、および上清を吸引。 FACS緩衝液200μlの細胞を再懸濁し、収集し、分析のためにフローサイトメトリーに進みます。
      注：細胞内フローサイトメトリー染色を行った場合は、ステップ4.2.2と4.2.3の間に固定し、透過処理工程および細胞内染色を行います。サイトカイン染色を行った場合、細胞が推奨されているように前活性化前の染色であるべきであり、そのようなモネンシンなどの細胞内タンパク質輸送および分泌の阻害剤は、への活性化中に使用されるべきです可溶性因子の保持を保証します。固定された細胞は、従来のフローサイトメーター上で取得する暗所で4℃で短期間（一週間）に格納されてもよいです。

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結果

下に表示される結果は、処理された黒色腫腫瘍に対する広範な免疫表現型のためのフローサイトメトリー・ゲーティング戦略を描いています。染色の当日は、組織サンプルは、225 RPMの回転下、37℃で、コラゲナーゼIと60分間インキュベーションのDNase Iで消化し、均質化しました。消化後、細胞懸濁液は、破片を除去するために70μmのセルストレーナーに通して濾過し、細胞を免疫細胞表?...

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ディスカッション

最終的には、処理の方法は、希望する仮説によって決定し、（ 図1）を実行することが技術的な分析を予想する必要があります。以下のセクションでは、組織切片上で実施することができる潜在的なアッセイを説明するための概要として役立ちます。それは、決して網羅的な概要であるが、技術を説明し、その長所と短所を列挙することにより、検体処理方法および下流アッセイ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957