עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Summary

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Abstract

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Introduction

מחקר רפואי נהנה מאוד מהמחקר של שני שורות תאים אנושיות ומודלים של בעלי חיים. שורות תאים מאפשרות שליטה טובה יותר של רכיבים במערכת, כמו גם שימוש בתאים מאורגניזם הנכון. עבודה עם תאים אנושיים, ואילו יותר נציג, מציג תמונת מצב פשוטה באופן דרסטי של מנגנונים שעשויות להיות אחראי לבריאות ומחלה, משום ששורות תאים עשויות שלא לשחזר את ההשפעה של תאים אחרים, רכיבי סטרומה, ואיברים אשר עשוי להשפיע ¹ תגובות. מצד השני, מודלים של בעלי החיים, אם כי לא לגמרי מדויק בשחזור מחלה אנושית וההטרוגניות גנטית, להציע תובנה נוספת על ידי מתן אפשרות להזנה של מערכות חיות שלמות ברוב הדגמים ^2,3.

חסרונות בצד, יש לי שתי השיטות היתרונות שלהם והם משלימים. עם זאת, המטרה העיקרית נשארה ללמוד בתאים אנושיים ואיברים, בגוף מלא, מערכת רב-איבר. בהתאם לכך, יש מחקר translational taken צעדים גדולים בקידום המחקר של איברים ורקמות שחולצו מחולים אנושיים, על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני מחלה בסיסית. מחקר translational מציע את היתרון של לימוד התוצאה מטיפולים ומחלות בכל הגוף ובתאים מתאימים, ובכך לספק את המיטב משני העולמות בין תא ובעלי חי עבודה ^4.

מחקר translational הוא גם לא בלי פגמים. דגימות שנקטפו מחולים אנושיים, עם ההסרה מהמארח, חשופות באופן מיידי לאיסכמיה וגורמים חיצוניים אחרים שממנו הם יהיו מוגנים אחרים. זה עלול לגרום לשינויים מולקולריים וגנטיים שנגרם עקב מתח, ולגרום להטיה במחקרים שלאחר מכן. לכן, הרבה מאמץ כבר הכניס לתוך חילוץ ועיבוד רקמות באמצעות שיטות קפדניות לשמירה הטובה ביותר איבר ושלמות תא ללימודים במורד הזרם ^5. חשוב לציין, יישומים עתידיים יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירה מקרוב שיטות oו עיבוד דגימות אנושיות, כמו שיטות מסוימות עלולות לפגוע במרכיבים תאיים ומסלולי איתות תוך חוסך אחרים.

לכל מחקר מעורב רקמות אנושיות, נושאי רגולטורים יש לטפל. לאחר דיווחי Tuskegee ולמונט, היה הולכים וגדל בעובדה שהמחקר ביו-רפואי היה קשור בסיכונים הגלומים לעתים קרובות וכתוצאה מכך דילמות אתיות בלתי נמנעות ^6. הצורך בסטנדרטים לאומיים הוכר והממשלה הפדרלית יצרה לוחות סקירה מוסדיים (IRBs) כאמצעי לשמירה על עקרונות הדו"ח בלמונט (כבוד לאנשים, חסד, המשפטים).

IRB כל מוסד הוא ועדה של רופאים, חוקרים וחברי קהילה שהם אחראים להגנת משתתפי מחקר. זה דורש כי הסכמה מרצון לקבל מכל משתתפי מחקרים ביו-רפואיים, וכי הסכמה זו תתועד בהסכמה מהדעת FO rm. תהליך ההסכמה מהדעת שמטרתו לספק מידע הולם למשתתף, כך שהחלטה מושכלת עשויה להיות על האם או לא להירשם ללימודים, או להמשיך השתתפות. בהקשר זה, מסמך ההסכמה מהדעת חייב להיות קריאה טובה וצריך להיות כתוב בשפה שיכול להיות מובנת בקלות (רמת קריאת הכיתה ^ה -6 עד 8 ^​​ה) על ידי אוכלוסיית היעד. האפשרות של כפייה או השפעה בלתי הוגנת חייבת להיות ממוזערת, והנושא יש לתת מספיק זמן לשקול השתתפות. המשתתף חייב להיות גם תוכל לממש את זכותם ללבטל את ההסכמה בכל שלב במהלך המחקר ללא קנס. הסכמה מדעת מרצון היא תנאי מוקדם הכרחי להשתתפותו של נושא במחקר והוא גם יעיל ⁷ באופן חוקי.

בהתאם לתקנות להגנה על האדם מכפיף 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8), יש ליידע משתתפי מחקר של מטרת המחקר, נהלים מעורבים במחקר, חלופות להשתתפות, כל סיכונים הנראה לעין ואי נוחות (כולל פגיעה לא רק פיזית אלא גם נזק פסיכולוגי, חברתי, כלכלי או אפשרי, אי נוחות, או אי נוחות), יתרונות של המחקר לחברה ואולי לאדם, משך זמן הנושא צפוי להשתתף, האדם ליצור קשר לקבלת תשובות לשאלות או במקרה של פגיעה הקשורות למחקר או לשעת חירום, הודעה, כי ההשתתפות היא בהתנדבות והסירוב שלהשתתף לא יגרום לכל השלכות או כל אובדן של הטבות כגון פשרה בטיפול קליני רגיל כי המשתתף זכאי אחר לקבל כתוצאה מ/ אבחנותיו, ובסופו הצהרה בדבר זכותו של הכפופים לסודיות וזכות לסגת מהמחקר בכל עת ללא כל השלכות. דגימות רקמה ממשתתפים שלבטל את ההסכמה במהלך המחקר לא צריכים להיות הפקידה ויש למצות באופן מיידי. ויתור של אחד או יותר אלמנטים של הסכמה מדעת ניתן לקבל מIRB לכמה פרויקטי מחקר שלא יכל כמעט להיעשות ללא שינוי לאלמנטים הנדרשים או ללימודים שבו אלמנטים הנדרשים אינם ישימים. יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח סודיות הנתונים. ביטוח בריאות הטלטלות הדין והחשבון Act (HIPAA) הוא חוק פדרלי שמונע את שימוש באו גילוי "מידע מוגן בריאות" (PHI) ללא הסכמה בכתב מהמשתתפים. אובדן כושר עבודה כוללת אך לא מוגבל למידע המועבר בבריאות או נשמר בכל צורה או בינוני וכולל תחומים שיכולים לשמש לזיהוי ⁹ בודדים.

דרך עבודה זו, אנו שואפים להתוות את הפרוטוקול שיש אחריו במהלך tissuעיבוד דואר - כוללים רכש, ואחסון ומדגישים את החשיבות של ביצוע הנחיות הקפדניות אלה כדי למזער את ההטיות שעלולות לגרום בשל לחצי רקמת נתונה על חילוץ. גם אנחנו נשתדל לספק סקירה קצרה של מבחני או ניתוחים (איור 1) שיכול להתבצע על דגימות כאלה במורד הזרם, כך שקוראים יכולים לעשות שיפוט מוסמך על מה assay (ים) המתאימים ביותר לצרכיהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת אתיקה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson.

1. רכש דגימה

1. לאסוף דגימות רקמה מגידול עודף מחקר ורקמות נורמליות קשורות ^10-12. דגימות חנות על קרח רטוב כדי למנוע autolysis.
2. שלח את כל הרקמות, מכשירים רפואיים וגופים זרים הוסרו במהלך ניתוח למחלקה לפתולוגיה לבדיקה הכרחית על מנת להקל על אבחנה פתולוגית.
3. ידית רקמה שהוקצתה למחקר בהתאם למחקר רלוונטי ומדיניות בנקאות רקמות ונהלים.
   הערה: אוסף Biospecimen כרוך בתיאום של הפתולוגים, 'פתולוגים עוזרים, histotechnologists ומומחי רכש רקמות.

2. פתולוגיה אבטחת איכות (QA)

1. השלם ולאמת רשומות מטופל כאמצעי QA מוקדם ולהתייעץ פתולוג לסקור רשות אבחוןרשומות tient (דוחות פתולוגיה, שקופיות רקמה, וכו ') ודגימות רקמה. דגימות רקמת שופט על מאפיינים מורפולוגיים של עניין, כגון אחוז הגידול, נמק, ממשק רקמת גידול, וכו 'זה הוא בהתאם לשיטות עבודה מומלצות biorepository ^10-12.
2. לאחר סקירה ראשונית, לערוך בדיקות תקופתיות של נתונים biorepository ודגימות מחקר במהלך כל משך שהות של biospecimen.
3. תוצאות קישור וביאורים מההיסטופתולוגיים ואחרות חקירות לדגימות ולספק את הנתונים לחוקרים באמצעות מערכת תוכנת קניינית biorepository.
   הערה: תהליכי QA להבטיח את השלמות של שני היבטים הקליניים וטכניים של פעולות biorepository.
4. לבצע בדיקות גנטיות ומולקולריות כדי לאמת ולאפיין את הדגימות לשימוש קליני.
5. לאסוף ולנתח נתונים המבוססים על משוב מחוקרים שכבר משתמשים דוגמאות לניסויי מעבדה. מַסלוּלדגימות באמצעות טכנולוגית הברקוד. מערכת מעקב אלקטרונית זה גם דגלה בשיטות עבודה המומלצות biorespository ^10-12.

3. דגימה / עיבוד רקמות

1. תמיד לאחסן דגימות רקמה טריות על קרח רטוב, ותהליך מהר ככל האפשר, על מנת להגביל את השינויים הנגרמים על ידי מיצוי של דגימת הרקמה מסביבתו הטבעית. נורמלי תהליך גידול בהתאמה ודגימות רקמת גידול בנפרד, כדי למנוע זיהום צולב.
   הערה: מבוסס על פרוטוקולי מחקר, עיבוד biospecimen יכול לערב אוסף של הדגימות בסוג אחד או יותר של תקשורת.
2. לפני תחילת התהליך, להכין צלחת פטרי סטרילית תרבות, אזמל, כמו גם מחט או מלקחיים לעיבוד רקמות. ודא שצינורות ערוכים, שכותרתו, והניחו את כדי להגביל את הזמן של עיבוד מדגם (איור 2).
3. כל המידע רלוונטי הרקמה, כגון שם החולה, מספר, טיפול, תאריךניתוח, ומידע רלוונטי אחר כפי שיהיה מתאים למחקר, צריך להיעשות נגישים בבסיס נתוני רקמות מוסדיים. מידע על חולה מוגבל צריך להתקיים במעבדה בנייר או בצורת גיליון אלקטרוני.
   הערה:. לאסוף מידע biospecimen רלוונטי לאופי של דהינו המחקר רק, מחקר בסיסי ביו-רפואי, מחקר קליני, מחקר translational, וכו 'לקבלת מידע ספציפית למחלה, צוות biorepository צריך לאסוף נתונים ההכרחיים בספרות הנוכחית וארגונים המסדירים ל להבטיח אבחון נכון ומחקר משמעותי. זה כולל אך אינו מוגבל לציוני גידול ומידע בימוי סרטן.
4. לתכנן את כל הניסויים הבאים הרצויים מראש, כדי להחליט על הגודל של חלקי רקמות הנדרשים לכל סוג של ניתוח, כמו גם את המיקום של חתכים. באופן אידיאלי, אם כי בלתי אפשרי, כל הניתוחים צריכים להיות נציג של סעיף הרקמה כל כדי להסביר heterogenei הרקמהטאי והטית מגבלה של ניתוחים במורד הזרם. הנח את כל פריטים הנדרשים מראש כמתואר באיור 2.
5. מניחים את דגימת הרקמה בצלחת פטרי התרבות הפתוחה, שטוחה על המשטח.
   הערה: אפשר מורשה בלבד צוות biorepository לטפל דגימות מזוהות ולסקור נתונים בריאות זיהו. חוקרים צריכים לגשת רק מי מזהה מטופל כפי שמתיר נחתמו ההסכמות הודיעו וכפי שמוסדר על ידי IRB. כל הדגימות חייבת להיות מסומנות כראוי וצריכה לכלול במינימום, סוג מספר זיהוי רקמות ורקמות ייחודי. אינו כולל כל אובדן כושר עבודה בתוויות, בהתאם לתקנות HIPAA.
6. בדוק מדגם מכל הזוויות, כדי להשיג הבנה טובה יותר של המבנה וממדיו. הצמד את המדגם לתחתית הצלחת עם המחט, ולהמשיך לחצות את הרקמות לאורך הציר הגדול ונציג הטוב ביותר שלה.
7. לגזור פיסה קטנה של רקמה ולמקם אותו בMICR 1.5 מיליליטר סטריליצינור ocentrifuge מכיל 1ml של פתרון הייצוב-רנ"א. מדגם זה יכול להיות ממוקם על קרח למשך שארית התהליך ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
   הערה: כאשר עובד עם RNA, תמיד צריכה להיות משוחק כפפות, ויש להשתמש בי טיפים מסנן RNAse ללא להגביל את הסיכויים של השפלה וזיהום RNA.
8. הנח את קלטת ביופסיה פתוחה ושכותרתו מראש במכסה של צלחת פטרי התרבות. לגזור פרוסה של רקמה לא עבה יותר 3 עד 5 מ"מ ולהעביר אותו לקלטת. מניחים את הקלטת ב 10% שנאגרו פורמלין ניטרלי (NBF) למינימום של 72 שעות. העבר את קלטת אתנול 70% לאחסון לטווח ארוך לפני פרפין-הטבעה.
   הערה: תיוג של קלטות צריכה להתבצע בעיפרון או עם סמנים מומלצים כשימוש בקסילן במהלך העיבוד יהיה אחרת למחוק תוויות.
9. לגזור פיסת הרקמה ולמקם אותו בתבנית רקמה. מכסה את קטע הרקמה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר), ולהקפיא אותו באופן מיידיב -20 ° C לcryosectioning. סעיף רקמה זו עשויה להיות מאוחסן ב -20 ° C עד מוכן לcryosectioning.
10. לגזור אחד או חלקים רבים של רקמות ולהעביר אותם לצינור 50 מיליליטר מכיל מאגר MACS (1x ופר פוספט (PBS), 0.5% בסרום שור עוברי (FBS), 2 מ"מ חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) לזרימה לאחר ניתוח cytometry . לcytometry זרימה, דגימות גדולות יותר עשויות להיות עדיפות כתאים עלולים ללכת לאיבוד בהתנערות גידול, קיבוע התא וpermeabilization בעת צורך. בדרך כלל, סעיף זה עשוי להילקח בסוף, לאחר שכל החלקים האחרים כבר מעובד. שאריות מדגם גידול נציג עשוי לשמש לcytometry זרימה. לחלופין, צינור זה ניתן לאחסן על 4 מעלות CO / N או המשמש לעיכול מייד לאחר צביעת הזרימה cytometric להשעית תא (ראה שלב 4 - זרימת Cytometric מכתים).
11. חותך שארית הרקמה לחתיכות לא גדולות יותר מגודל מרבי של 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ ולהעביר אותם לקירורבקבוקונים להקפאה מיידית בחנקן נוזלי. דגימות Snap-קפוא אלה עשויות לשמש לעתיד ניתוחים ומטרות משותפות.
    הערה: טיפול נוסף יש לנקוט בעת עבודה עם חנקן נוזלי כקשר ישיר יכול לגרום לפציעה חמורה. עיניים צריכה להיות מוגנות עם משקפיים בטיחות עם מגיני צד או עם מגן פנים. צריכים גם להיות משוחק כפפות קריוגני כדי להגן מפני כוויות חנקן נוזליים הנגרמות על ידי תזה ומגע ישיר. כפפות צריכים להתאים כראוי אבל להיות משוחרר מספיק כדי להסיר במהירות צריך להתיז חנקן הנוזלי לתוכם.

4. זרימה Cytometric מכתים

1. Homogenization רקמה
   1. הכן בינוני עיכול עם DMEM (40 מיליליטר), DNase אני (50 U / ml) וCollagenase אני (2 מ"ג / מיליליטר). מניחים גידול טרי או O / מאוחסן-N במאגר MACS במכסה של צלחת פטרי, ולצלול עם מדיום עיכול.
      הערה:. שיטות עיכול שונות קיימות, כל אחד עם יתרונות כלומר, לשעבר חלבון פני תא (pression, כדאיות). ודא שיש לך את השיטה המתאימה ליישום במורד הזרם הרצוי.
   2. גידול צמד לתחתית הצלחת עם מחט, ולחתוך ממחוץ למרכז עם אזמל, עד הגידול בעל מרקם כמו דבק. העבר את תערובת גידול לשפופרת 50 מיליליטר, חותם ומקום בשקית פלסטיק, כדי למנוע הדלפות. העבר את הצינור לחממה, ולסובב ב 225 סל"ד, 37 ° C, 1 שעה.
   3. סנן השעיה תא סרטנית דרך מסננת תא 70μm. השעיה תא צנטריפוגה ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. גלולה תא גלולה במאגר 1 מיליליטר FACS (500 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר 0.5 M המניה EDTA, FCS 10 מיליליטר או FBS).
   4. ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות בריכוז של 1x10 מיליליטר / ⁷ תאים. העברה לכל גם 100 μl (10 ⁶ תאים) בצלחת תחתונה גם עגולה 96 לצביעה.
2. כדאיות ונוגדן מכתים
   1. הוסף 200 μl של פתרון כתם כדאיות היטב כל אחד ולערבב. Incuבייט במשך 30 דקות, בשעת 4 מעלות צלזיוס, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant.
   2. להוסיף תערובת נוגדנים בריכוז מומלץ / טיטרציה (לפי יצרן) לאנטיגנים משטח ב200 μl של חיץ FACS. דגירה תאים ב 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant.
   3. לשטוף עם 200 μl של חיץ FACS, ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של חיץ FACS ולהמשיך לזרום cytometer לרכישה וניתוח.
      הערה: אם ביצוע צביעת cytometry זרימה תאית, לבצע קיבוע וצעדי permeabilization וצביעה תאית בין צעדי 4.2.2 ו4.2.3. אם ביצוע מכתים ציטוקינים, תאים צריכים להיות הכתמה קודמת הופעל מראש מומלצים, ומעכב של תחבורה תאית חלבון והפרשה כגון monensin יש להשתמש בעת הפעלה ללהבטיח שמירה על גורמים מסיסים. תאים קבועים ניתן לאחסן לטווח קצר (שבוע) על 4 מעלות צלזיוס בלפני הרכישה הכהה על cytometer זרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוצאות מוצגות להלן מתארות אסטרטגית gating cytometry זרימה לphenotyping חיסוני רחב על גידול מלנומה מעובד. היום של צביעה, דגימת רקמה הייתה מתעכל והומוגני עם אני collagenase וDNase אני דגירה של 60 דקות, על 37 מעלות צלזיוס מתחת 225 סל"ד סיבוב. בעקבות עיכול, השעיה תא הייתה מסוננת דרך מסננת ת?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

סופו של דבר, שיטות העיבוד חייבים להיות מוכתבות על ידי ההשערה הרצויה וצפויות מבחני טכניים שיש לבצע (איור 1). הסעיף הבא משמש כסקירה לתאר מבחני פוטנציאליים שעלולות להתבצע על סעיפי רקמות כזה. זה בשום פנים וסקירה ממצה, אבל הוא נועד לסייע לשיטות עיבוד מדגם מדריך ובח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957