Travailler avec les tissus humains pour la recherche translationnelle sur le cancer

Résumé

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Résumé

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Introduction

La recherche médicale a énormément bénéficié de l'étude de deux lignées de cellules humaines et des modèles animaux. Les lignées cellulaires permettent un meilleur contrôle des composants dans un système, ainsi que l'utilisation de cellules de l'organisme approprié. Travailler avec des cellules humaines, tandis que plus représentatif, présente un aperçu simplifié radicalement les mécanismes qui peuvent être responsables de la santé et de la maladie, parce que les lignées cellulaires peuvent ne pas récapituler l'impact d'autres cellules stromales, composants et organes qui peuvent influer sur les réponses ^1. D'autre part, les modèles animaux, mais pas tout à fait exact de reproduction dans la maladie humaine et l'hétérogénéité génétique, offrent un meilleur aperçu en permettant l'entrée de systèmes animaux entiers dans la plupart des modèles ^2,3.

Lacunes côté, les deux méthodes ont leurs avantages et sont complémentaires. Cependant, l'objectif principal reste à étudier les cellules et d'organes humains, dans un système multi-organe corps entier. En conséquence, la recherche translationnelle a taken de grands progrès en vue de faciliter l'étude des organes et tissus humains extraites de patients, afin de mieux saisir les mécanismes maladie sous-jacente. La recherche translationnelle offre l'avantage d'étudier le résultat des traitements et des maladies dans tout le corps et dans les cellules appropriées, fournissant ainsi le meilleur des deux mondes entre la cellule et animale travail ^4.

La recherche translationnelle est également pas sans défauts. Spécimens récoltés provenant de patients humains, lors de l'enlèvement de l'hôte, sont immédiatement soumis à une ischémie et d'autres facteurs externes à partir de laquelle ils seraient autrement protégés. Cela peut entraîner des changements moléculaires et génétiques induites par le stress, et causer des biais dans les études ultérieures. Par conséquent, beaucoup d'efforts ont été mis en extraction et le traitement des tissus par des méthodes strictes de préserver au mieux l'orgue et l'intégrité des cellules pour des études en aval ^5. Surtout, les applications futures doivent être considérés de près lors de la sélection des méthodes of traitement des échantillons humains, que certaines méthodes peuvent être préjudiciables à des composants cellulaires et les voies de signalisation tout en épargnant les autres.

Pour toute recherche impliquant des tissus humains, les questions de réglementation doivent être abordées. Après les rapports de Tuskegee et Belmont, il y avait une acceptation croissante du fait que la recherche biomédicale a été associée à des risques inhérents résultant souvent des dilemmes éthiques inévitables ^6. La nécessité de normes nationales a été reconnue et le gouvernement fédéral a créé Institutional Review Board (IRB) comme un moyen de faire respecter les principes du Rapport Belmont (respect des personnes, la bienfaisance, de la justice).

La CISR de toute institution est un comité de médecins, les chercheurs et les membres de la communauté qui sont responsables de la protection des participants à la recherche. Il exige que le consentement volontaire être obtenu à partir de tous les participants des études de recherche biomédicale, et que ce consentement soit documentée dans un consentement éclairé fo rm. Le processus de consentement éclairé vise à fournir des informations adéquates à un participant, de sorte qu'une décision éclairée peut être faite ou non d'inscrire dans une étude, ou de continuer à participer. À cet égard, le document de consentement éclairé doit avoir une bonne lisibilité et doit être écrit dans un langage qui peut être facilement comprise ⁽⁶ e à 8 ^e niveau de lecture de qualité) par la population cible. La possibilité de la contrainte ou influence indue doit être minimisée, et le sujet doit être donné suffisamment de temps pour envisager une participation. Le participant doit également être autorisés à exercer leur droit de retirer son consentement à tout moment au cours de l'étude, sans pénalité. Consentement éclairé est un pré-requis obligatoire pour la participation d'un sujet dans la recherche et il est aussi légalement ^à compter du 7.

Comme par les règlements pour la protection des sujets humains 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8), les participants de l'étude doivent être informés de l'objet de la recherche, les procédures impliquées dans la recherche, les alternatives à la participation, tous les risques prévisibles et les malaises (y compris non seulement des blessures physiques, mais aussi un préjudice psychologique, sociale, économique ou possible, d'inconfort ou gêne), les avantages de la recherche pour la société et, éventuellement, à l'individu, la durée de l'objet devrait participer, personne à contacter pour obtenir des réponses aux questions ou dans le cas d'une blessure liée à la recherche ou d'urgence, une déclaration indiquant que la participation est volontaire et que le refus de participer ne sera pas entraîner des conséquences ou toute perte d'avantages tels que un compromis dans les soins cliniques réguliers que le participant est autrement habilité à recevoir en raison de son / ses diagnostics, et enfin une déclaration concernant le droit de la personne à la confidentialité et le droit de se retirer del'étude à tout moment sans aucune conséquence. Les échantillons de tissus de participants qui se retirent consentement au cours de l'étude ne devraient pas être mis en réserve et doivent être immédiatement épuisées. Renonciation à un ou plusieurs éléments du consentement éclairé peut être obtenu à partir de la CISR pour certains projets de recherche qui pourraient pratiquement pas se faire sans une modification des éléments requis ou pour des études où les éléments nécessaires ne sont pas applicables. Un grand soin doit être pris pour assurer la confidentialité des données. La Loi sur la responsabilité Health Insurance Portability et (HIPAA) est une loi fédérale qui empêche utiliser ou de divulguer «renseignements protégés de la santé" (PHI) sans le consentement écrit des participants. PHI comprend mais ne se limite pas à l'information de santé transmis ou maintenu sous quelque forme ou moyen et comprend des champs qui pourraient être utilisés pour identifier une personne ^9.

Grâce à ce travail, nous visons à décrire le protocole qui doit être suivi pendant tissue traitement - y compris les achats, le stockage et soulignent l'importance de suivre ces lignes directrices strictes de manière à minimiser les biais qui peuvent résulter en raison des contraintes d'un tissu est soumis à lors de l'extraction. Nous nous efforçons également de fournir un bref aperçu des essais ou d'analyses (Figure 1) qui pourraient être effectuées sur ces échantillons en aval afin que les lecteurs peuvent porter un jugement qualifié sur ce test (s) convient le mieux à leurs besoins.

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Protocole

Déclaration éthique: Ce protocole est approuvé par l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center.

1. Echantillon achats

1. Prélever des échantillons de tissus de recherche du surplus tumeur et les tissus normaux connexes ^10-12. Stocker les spécimens sur la glace humide pour éviter autolyse.
2. Envoyer tous les tissus, les dispositifs médicaux et les corps étrangers enlevés au cours d'une intervention chirurgicale pour le Département de pathologie pour examen nécessaire afin de faciliter un diagnostic pathologique.
3. Poignée tissu alloué à la recherche, conformément à la recherche et aux politiques applicables de la banque de tissus et de procédures.
   REMARQUE: la collecte des échantillons biologiques implique la coordination des pathologistes pathologistes 'assistants, technologistes en histologie et spécialistes de l'approvisionnement des tissus,.

2. Assurance Qualité pathologie (AQ)

1. Compléter et vérifier les dossiers des patients comme une mesure d'AQ tôt et consulter un médecin pour examiner pa diagnostictients dossiers (rapports de pathologie, les lames de tissus, etc.) et des échantillons de tissus. Des échantillons de tissus juge sur les caractéristiques morphologiques d'intérêt tels que le pourcentage de la tumeur, la nécrose, l'interface tissu tumoral, etc. Ceci est en conformité avec les meilleures pratiques biodépôt ^10-12.
2. Après l'examen initial, des examens périodiques de données et banque d'échantillons des échantillons de recherche pendant toute la durée du séjour des échantillons biologiques.
3. Résultats de Lien et annotations d'enquêtes histopathologiques et d'autres à des échantillons et fournissent ces données pour les chercheurs grâce à un système de logiciel de biodépôt propriétaire.
   REMARQUE: processus d'assurance qualité garantissent l'intégrité des deux les aspects cliniques et techniques des opérations biodépôt.
4. Effectuer des tests génétiques et moléculaires pour vérifier et caractériser les échantillons pour une utilisation clinique.
5. Recueillir et analyser les données basées sur les commentaires des chercheurs qui ont utilisé les échantillons pour des expériences de laboratoire. Pisteéchantillons en utilisant la technologie de code à barres. Ce système de suivi électronique est également préconisée dans les meilleures pratiques biorespository ^10-12.

3. Spécimen / Traitement des tissus

1. Toujours stocker des échantillons de tissus frais sur la glace mouillée, et le processus aussi rapidement que possible, afin de limiter les changements induits par l'extraction de l'échantillon de tissu de son environnement naturel. Procédé normale tumeur appariés et des échantillons de tissus tumoraux séparément pour éviter la contamination croisée.
   REMARQUE: Basé sur les protocoles de recherche, de traitement des échantillons biologiques peut impliquer la collecte des spécimens dans un ou plusieurs types de médias.
2. Avant de commencer le processus, préparer une boîte de Pétri stérile de culture, un scalpel, ainsi que d'une aiguille ou une pince pour le traitement des tissus. Veiller à ce que les tubes ont été préparés, étiquetés et mis en oeuvre pour limiter le temps de traitement des échantillons (figure 2).
3. Toutes les informations pertinentes de tissu, telles que le nom du patient, le numéro, le traitement, la date dela chirurgie, et d'autres informations pertinentes peut être approprié pour l'étude, devraient être facilement accessibles dans une base de tissu institutionnel. Des informations limitées patient doit être maintenu dans le laboratoire sous forme papier ou de feuille de calcul.
   NOTE:. Seulement recueillir des informations échantillons biologiques pertinents à la nature du savoir de la recherche, de la recherche biomédicale fondamentale, la recherche clinique, la recherche translationnelle, etc. Pour plus d'informations spécifiques à la maladie, le personnel biodépôt devrait recueillir des données jugées nécessaires par la littérature actuelle et organismes directeurs de assurer le bon diagnostic et la recherche de sens. Cela inclut, mais ne se limite pas aux classes de tumeurs et le cancer informations de stockage intermédiaire.
4. Planifiez toutes les expériences ultérieures souhaitées à l'avance, de décider de la taille des coupes de tissus requis pour chaque type d'analyse, ainsi que l'emplacement des excisions. Idéalement, bien impossible, toutes les analyses doivent être représentatifs de la coupe de tissu ensemble afin de rendre compte de heterogenei de tissusTy et limiter les biais d'analyses en aval. Disposez tous les éléments nécessaires à l'avance comme le montre la figure 2.
5. Placer l'échantillon de tissu dans la boîte de culture Petri ouverte, à plat contre la surface.
   REMARQUE: autorise uniquement le personnel autorisé biodépôt à manipuler les échantillons identifiés et à examiner les données de santé identifiés. Les enquêteurs devraient uniquement accéder aux identifiants de patients comme le permet la signés consentements éclairés et réglementé par la CISR. Tous les échantillons doivent être adéquatement étiquetés et doivent comprendre au minimum, un numéro d'identification des tissus et des tissus de type unique. Ne pas inclure les RPS dans les étiquettes, conformément à la réglementation HIPAA.
6. Inspecter l'échantillon de tous les angles, à acquérir une meilleure compréhension de sa structure et les dimensions. Epingler l'échantillon au fond du plat avec l'aiguille, et de procéder à découpent le tissu le long de son axe plus grand et le meilleur représentant.
7. Découpez un petit morceau de tissu et le placer dans un stérile 1,5 ml MICRTube ocentrifuge contenant 1 ml de solution d'ARN-stabilisation. Cet échantillon peut être placé sur de la glace pendant le reste du procédé et stocké à 4 ° C jusqu'à utilisation.
   REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec de l'ARN, les gants doivent toujours être portés, et des conseils de filtres RNase-Free doit être utilisé pour limiter les chances de la dégradation et de la contamination de l'ARN.
8. Étalez une cassette ouverte et pré-étiquetés biopsie dans le couvercle de la boîte de culture Petri. Découper une tranche de tissu pas plus épais que 3 à 5 mm et le transférer sur la cassette. Placez la cassette dans 10% formol neutre tamponné (FBN) pour un minimum de 72 heures. Transférer la cassette dans 70% d'éthanol pour le stockage à long terme avant la paraffine-encastrement.
   REMARQUE: étiquetage des cassettes doit être effectué au crayon ou avec des marqueurs recommandés que l'utilisation de xylène pendant le traitement, autrement effacer les étiquettes.
9. Découper un morceau de tissu et le placer dans un moule de tissu. Couvrir la coupe de tissu à la température de coupe optimale (OCT) composé, et de geler immédiatementà -20 ° C pendant cryosectioning. Cette section de tissu peut être conservé à -20 ° C jusqu'au moment de cryosectioning.
10. Découper une ou plusieurs pièces de tissu et les transférer vers un tube de 50 ml contenant du tampon MACS (1x tampon phosphate salin (PBS), 0,5% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) pour l'écoulement ultérieur analyse par cytométrie . Pour la cytométrie de flux, de plus grands échantillons peut être préférable que les cellules peuvent être perdues lors de la dissociation de la tumeur, la fixation cellulaire et perméabilisation lorsque requis. Généralement, cette section peut être prise à la fin, une fois toutes les autres pièces ont été traitées. Les restes représentant échantillon de tumeur peut être utilisé pour la cytométrie de flux. Eventuellement, ce tube peut être conservé à 4 ° CO / N ou utilisé pour cytométrie de flux coloration digestion immédiatement après dans une suspension de cellules (voir l'étape 4 - cytométrie en flux coloration).
11. Couper reste de tissu en morceaux pas plus gros qu'une taille maximale de 0,5 mm x 0,5 mm et les transférer à cryogéniqueflacons pour congélation immédiate dans l'azote liquide. Ces échantillons d'encliquetage congelés peuvent être utilisés pour de futures analyses et à des fins de collaboration.
    NOTE: Des précautions supplémentaires devraient être prises lorsque l'on travaille avec de l'azote liquide en contact direct peut causer des blessures graves. Les yeux doivent être protégés par des lunettes de sécurité avec écrans latéraux ou avec un écran facial. Des gants cryogéniques devraient également être portés pour protéger contre les brûlures d'azote liquides causées par des éclaboussures et le contact direct. Les gants doivent ajuster correctement, mais être suffisamment lâche pour être retiré rapidement si splash de l'azote liquide en eux.

4. La coloration par cytométrie en flux

1. L'homogénéisation des tissus
   1. Préparer milieu de digestion avec du DMEM (40 ml), de DNase I (50 U / ml) et de la collagénase I (2 mg / ml). Placez frais ou O tumeur / N-stockée dans un tampon MACS dans le couvercle d'une boîte de Pétri, et plonger avec un milieu de digestion.
      NOTE:. Méthodes de digestion Il existe différentes, chacune ayant ses avantages (par exemple, la surface des cellules de protéines expression, la viabilité). Assurez vous d'avoir la bonne méthode pour votre application en aval souhaitée.
   2. Pin tumeur au fond de la boîte avec une aiguille, et la coupe de l'extérieur pour centrer avec un scalpel jusqu'à ce que la tumeur a une texture pâteuse. Transfert mélange de la tumeur à un tube de 50 ml, joint et le placer dans un sac en plastique pour éviter les fuites. Transfert tube pour un incubateur, et tourner à 225 tours par minute, 37 ° C, 1 h.
   3. Filtre tumeur suspension de cellules à travers un tamis de 70 pm de la cellule. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS (500 ml de PBS, 1 ml de 0,5 M de stock EDTA, 10 ml de FCS ou FBS).
   4. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et remettre en suspension à une concentration de 1x10 ⁷ cellules / ml. Transfert 100 pi par puits (10 ⁶ cellules) dans une plaque de 96 puits à fond rond pour la coloration.
2. La viabilité et la coloration des anticorps
   1. Ajouter 200 pi de solution viabilité de tache pour chaque puits et mélanger. Incubate pendant 30 minutes, à 4 ° C, dans l'obscurité. Isoler les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant.
   2. Ajouter le mélange d'anticorps à concentration recommandée (selon le fabricant) / titré pour les antigènes de surface dans 200 pi de tampon FACS. Incuber les cellules à 4 ° C, 30 min, à l'obscurité. Isoler les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant.
   3. Laver avec 200 pi de tampon FACS, centrifuger les cellules à 250 xg, 4 ° C, 5 min, et aspirer le surnageant. Reprendre les cellules dans 200 pi de tampon FACS et de procéder à un cytomètre en flux pour l'acquisition et l'analyse.
      NOTE: Si vous effectuez flux intracellulaire coloration de cytométrie, effectuez les étapes de fixation et de perméabilisation et la coloration intracellulaire entre les étapes 4.2.2 et 4.2.3. Si vous effectuez cytokine coloration, les cellules doivent être pré-activé coloration précédent comme l'a recommandé, et d'un inhibiteur du transport intracellulaire des protéines et la sécrétion tels que monensin devrait être utilisé pendant l'activation deassurer la rétention de facteurs solubles. Les cellules fixées peuvent être conservées à court terme (1 semaine) à 4 ° C dans l'obscurité avant l'acquisition sur un cytomètre de flux.

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Résultats

Les résultats affichés ci-dessous illustrent l'écoulement stratégie cytométrie de déclenchement d'une large phénotypage immunitaire sur une tumeur de mélanome traités. Le jour de la coloration, l'échantillon de tissu a été digéré avec de la collagénase et on les homogénéise et DNase I I incubation pendant 60 min, à 37 ° C sous 225 RPM rotation. Après la digestion, la suspension cellulaire a été filtrée à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et les cell...

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Discussion

En fin de compte, les méthodes de traitement doivent être dictées par l'hypothèse souhaité et prévu des essais techniques à effectuer (Figure 1). La section suivante sert un aperçu de décrire dosages potentiels qui peuvent être effectuées sur ces coupes de tissus. Il est en aucun cas un aperçu exhaustif, mais est destiné à aider à guidage méthodes de traitement des échantillons et choix des essais en aval en décrivant les techniques et la liste de leurs forces et faiblesses.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957