번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업

요약

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

초록

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

서문

의학 연구는 인간 세포주 및 동물 모델 모두 연구 막대한 이득이다. 세포주 나은 시스템의 구성 요소의 제어뿐만 아니라, 적절한 유기체의 세포의 사용을 허용한다. 세포주는 응답 ^{(1)에 영향을} 미칠 수있는 다른 세포, 기질 구성 요소 및 기관의 영향을 요점을 되풀이하지 않을 수 있기 때문에, 더 대표하면서, 건강과 질병에 대한 책임을 질 수 있습니다 메커니즘을 획기적으로 단순화 된 스냅 샷을 제공, 인간 세포에 대한 작업. 반면에, 동물 모델은 인간의 질병 및 유전 적 이질성 재생 전적으로 정확하지 않지만, 대부분의 모델 동물 ^2,3-에서 전체 시스템의 입력을 허용함으로써 추가 통찰력을 제공.

단점은 제쳐 놓고, 두 방법은 자신의 장점을 가지고 상호 보완 적이다. 그러나, 주요 목표는 전신, 멀티 기관 시스템에서 인간의 세포와 기관, 연구 남아있다. 따라서, 중개 연구는 탁을 가지고더 나은 메커니즘을 기저 질환을 파악하기 위해, 인간의 기관 및 환자에서 추출한 조직의 연구를 촉진 장족의 발전 갖추고 있습니다. 중개 연구함으로써, 몸 전체에서 적절한 세포에서 치료 및 질환의 연구 결과와 동물 세포 일 ⁽⁴⁾ 사이 모두의 장점을 제공하는 이점을 제공한다.

중개 연구는 결함없이도 없습니다. 인간의 환자에서 수확 표본, 호스트로부터 제거시 즉시 허혈하고 그렇지 않으면 보호 될 수있는 다른 외부 요인을 실시한다. 이 스트레스 유발 분자 유전 학적 변화가 발생하고, 이후의 연구에서 편견의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 많은 노력이 가장 하류 연구 ⁵ 장기 및 세포의 무결성을 유지하기 위해 엄격한 방법으로 조직을 추출하고 처리에 투입되었다. 방법 (을)를 선택했을 때 중요한 것은, 미래의 응용 프로그램은 밀접하게 고려되어야한다F 특정 방법은 세포 성분에 유해 할 수 있으므로, 인간의 샘플을 처리하고 다른 사람을 살려주는 동안 신호 전달 경로.

인체 조직을 포함하는 모든 연구, 규제 문제를 해결해야합니다. 터스 키기과 벨몬트 보고서 이후, 생물 의학 연구는 고유의 위험은 종종 피할 수없는 윤리적 딜레마 ^(6)의 결과와 관련되었다는 사실의 성장 수용이 있었다. 국가 표준의 필요성을 인식하고, 연방 정부는 벨몬트 보고서의 원칙을 유지 (명, 선행, 정의에 대한 존중)하는 수단으로 임상 시험 심사 보드 (IRBs를) 만들었습니다.

모든 기관의 IRB는 연구 참가자를 보호 할 책임이 있습니다 의사, 연구자 및 지역 사회 구성원의위원회이다. 그것은 자발적 동의는 생물 의학 연구의 모든 연구 참가자를 얻을 수 있어야하고,이 동의는 동의 FO에 설명하는 것이 RM. 동의서 프로세스 정보 결정은 연구에 등록 또는 가입 상태를 유지할지 여부에 제조 될 수 있도록 참가자에게 적절한 정보를 제공하는 것을 목적으로한다. 이와 관련, 동의서 문서는 좋은 가독성이 있어야 쉽게 표적 집단에 의해 (6 ^일 ~ 8 ^학년 읽기 수준) 이해 될 수있다 언어로 작성되어야한다. 강압 또는 부당한 영향의 가능성을 최소화 할 수 있어야하고, 피사체가 참여를 고려할 충분한 시간이 주어져야한다. 참가자는 처벌하지 않고 연구의 과정에서 모든 단계에서 동의를 철회 할 수있는 권리를 행사할 수 있어야합니다. 자발적인 동의서는 연구 주체의 참여를위한 필수 전제 조건이며 또한 ⁷ 법적으로 유효하다.

인간의 보호를위한 규정에 따라 과목 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html ^8), 연구 참가자는 연구의 목적을 통보해야하며, 연구에 참여 절차 참여에 대한 대안, 사회에 대한 가능성이 개인에게 연구의 모든 예측 가능한 위험과 불편 (뿐만 아니라 신체적 상해뿐만 아니라 수, 심리적, 사회적, 경제적 피해, 불편 함, 또는 불편 포함), 혜택, 피사체가 참여 할 것으로 예상되는 시간의 길이, 사람은 참여가 자발적임을 나타내는 문, 질문에 대한 또는 연구 관련 부상이나 응급 상황에 대한 답을 문의하고 참여하는 것을 거부는 정기적으로 임상 치료에 타협으로 어떤 결과 또는 혜택을 상실하지 않습니다 참가자가 다른 권리가 있음을 기밀성과에서 철수하는 오른쪽에있는 피사체의 권리에 관한 마지막으로 문을 그 / 그녀의 진단의 결과로 수신하고어떤 결과없이 언제든지 연구. 연구의 과정에서 동의를 철회 참가자의 조직 표본 뱅크해서는 안 즉시 소진해야합니다. 동의서의 하나 또는 그 이상의 요소의 면제는 실질적으로 필요한 요소 또는 필수 요소가 적용되지 않습니다 연구에 대한 변경없이 할 수없는 몇 가지 연구 프로젝트에 대한 IRB에서 얻을 수있다. 큰 관심은 데이터의 기밀성을 보장하기 위해주의해야합니다. 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA)을 사용하거나 참가자의 서면 동의없이 "보호 된 건강 정보"(PHI)를 공개 방지 연방법입니다. PHI 포함하지만 의료 정보 전송되거나 유지 어떠한 형태 또는 매체와 ^{9 개인을} 식별하는 데 사용될 수있는 필드들에 한정되지 않는다.

이 작품을 통해 우리는 tissu 과정에서 지켜야하는 프로토콜을 간략하게 설명하는 것을 목표로전자 처리 - 조달을 포함하고, 저장하고 조직 추출시에받는 응력으로 인해 발생할 수 편향을 최소화하기 위하여 이러한 엄격한 가이드 라인을 다음의 중요성을 강조한다. 독자가 무엇을 분석 (들)에 가장 적합한 자신의 요구에 자격을 갖춘 판단을 할 수 있도록 우리는 또한 다운 스트림 분석 또는 표본에 대해 수행 할 수있는 분석 (그림 1)에 대한 간략한 개요를 제공하기 위해 노력하고 있습니다.

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프로토콜

윤리 문 :이 프로토콜은 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에 의해 승인됩니다.

1. 표본 조달

1. 잉여 종양 및 관련 정상 조직 ^10-12에서 연구 조직 샘플을 수집합니다. 젖은 얼음에 보관 검체는자가 분해를 방지 할 수 있습니다.
2. 병리학 적 진단을 용이하게하기 위해 모든 조직, 의료 기기 및 필요한 검사에 대한 병리학 부서 수술 중 제거 이물질을 보냅니다.
3. 적용 할 수있는 연구 조직 은행의 정책 및 절차에 따라 연구에 할당 된 조직을 처리합니다.
   참고 : Biospecimen 컬렉션 병리학의 조정을 포함, 병리학 '조수, histotechnologists 및 조직 조달 전문가.

2. 병리학 품질 보증 (QA)

1. 완료하고 초기 품질 보증 조치로 환자 기록을 확인하고 진단 PA를 검토 병리학에 문의tient 레코드 (병리학 리포트, 조직 슬라이드 등) 및 조직 샘플. 등이 biorepository 모범 사례 ^10-12에 따른다 등 종양의 비율, 괴사, 조직 종양 인터페이스, 같은 관심의 형태 학적 특성에 대한 판사의 조직 샘플.
2. 초기 검토 후, biospecimen의 숙박의 전체 길이 중 biorepository 데이터와 연구 샘플의주기적인 검토를 수행.
3. 샘플 및 기타 병리학 적 조사 결과로부터 링크와 주석 및 biorepository 독점 소프트웨어 시스템을 통해 연구원이 데이터를 제공한다.
   주 : QA 프로세스 biorepository 동작 임상 기술적 측면 모두의 무결성을 보장한다.
4. 확인하고 임상 사용을 위해 샘플을 특징 짓는 유전 및 분자 테스트를 수행합니다.
5. 수집 및 실험실 실험 샘플을 사용하고 연구자의 의견을 기반으로 데이터를 분석 할 수 있습니다. 선로바코드 기술을 사용하여 샘​​플. 이 전자 추적 시스템은 biorespository 모범 사례 ^10-12에서 주장한다.

3. 표본 / 조직 처리

1. 항상 그것의 자연 환경으로부터 조직 샘플의 추출에 의해 유도 된 변화를 제한하기 위해, 가능한 한 빨리 신선한 조직 젖은 얼음 표본, 및 프로세스를 저장한다. 종양 정상적인 프로세스 정합 및 종양 조직 샘플을 별도의 교차 오염을 방지하기 위해.
   주 : 연구 프로토콜에 근거는 biospecimen 처리 매체의 하나 이상의 유형에 시험편의 컬렉션을 포함 할 수있다.
2. 프로세스를 시작하기 전에, 멸균 페트리 배양 접시, 메스뿐만 아니라, 조직 처리 용 바늘 또는 집게를 준비한다. 튜브가 준비 표지 및 샘플 처리 (그림 2)의 시간을 제한하기 위해 배치되어 있는지 확인합니다.
3. 이러한 환자 이름, 번호, 치료, 날짜 등 모든 관련 조직 정보,수술 및 연구에 적합한 수있는 바와 같이, 다른 관련 정보는, 기관 조직 데이터베이스에 용이하게 접근해야한다. 제한된 환자 정보는 종이 또는 스프레드 시트 형태로 실험실에서 개최한다.
   참고 :. 만 연구 즉의 성격과 관련 biospecimen 정보를 수집, 질병 별 정보 등 기본적인 생물 의학 연구, 임상 연구, 중개 연구는 biorepository 직원은 현재 문학이 필요하다고 인정하는 데이터를 관리하는 조직을 수집해야 적절한 진단과 의미있는 연구를 보장합니다. 하지만, 여기에는 종양 등급과 암 스테이징 정보에 한정되지 않는다.
4. 각 유형의 분석뿐만 아니라, 절개의 위치에 대해 요구되는 조직 절편의 크기를 결정하기 위해, 미리 원하는 모든 후속 실험을 계획한다. 불가능 비록 이상적으로, 모든 분석은 조직 heterogenei을 고려하기 위해 전체 조직 절편을 대표한다타이 및 다운 스트림 분석의 한계 바이어스. 그림 2에 도시 된 바와 같이 사전에 필요한 모든 항목을 배치합니다.
5. 표면에 평평하게 열려있는 페트리 배양 접시에서 조직 표본을 놓습니다.
   참고 : 만 확인 된 샘플을 처리하고 확인 된 건강 데이터를 검토 할 수 biorepository 직원에게 권한을 부여 할 수 있습니다. 연구자는 IRB에 의해 규제로 서명 된 정보를 동의에 의해 허용하고 만 환자 식별자에 액세스해야합니다. 모든 시편은 적절하게 표시해야하며, 최소한의 고유 한 조직 식별 번호 및 조직 유형에 포함해야한다. HIPAA 규정에 따라, 라벨의 모든 건강 정보를 포함하지 마십시오.
6. 그 구조 및 치수의 더 나은 이해를 얻기 위해, 모든 각도에서 샘플을 검사한다. 바늘 접시의 바닥에 샘플을 핀과 최대 규모의 가장 대표적인 축을 따라 조직을 양분로 진행합니다.
7. 조직의 작은 조각을 잘라 멸균 1.5 ml의 MICR에 배치RNA 안정화 용액 1ml를을 포함 ocentrifuge 튜브. 이 샘플은 프로세스의 나머지 얼음에두고 필요할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
   참고 : RNA로 작업 할 때 장갑을 항상 착용해야하고, RNAse가없는 필터 팁 저하와 RNA 오염의 기회를 제한하는 데 사용되어야한다.
8. 페트리 배양 접시의 뚜껑을 열고 미리 라벨링 생검 카세트를 배치합니다. 3-5mm보다 더 두꺼운 조직의 조각을 잘라 카세트로 전송. 72 시간의 최소 10 %에서 카세트 중성 포르말린 (NBF)를 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 장기간 저장을 위해 70 % 에탄올에 카세트를 옮긴다.
   참고 : 카세트 라벨은 연필 또는 다른 라벨을 지워집니다 처리 중 자일 렌의 사용을 권장 마커로 수행되어야한다.
9. 조직의 조각을 잘라 및 조직 금형에 넣습니다. 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직 절편을 커버하고, 즉시 동결냉동 절편을 위해 -20 ° C에서. 이러한 조직 절편은 저온 절편 위해 준비 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
10. 하나 잘라 또는 조직의 많은 조각 및 MACS 완충액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 (1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 0.5 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)) 세포 계측법 분석 후속 유동로 전송할 . 유동 세포 계측법에 필요한 경우 세포가 종양 탈퇴, 세포의 고정과 투과성으로시 손실 될 수 있으므로, 큰 샘플은 바람직 할 수있다. 일반적으로,이 섹션은 단부에서 취할 수 있고, 일단 다른 모든 부분이 처리되어있다. 남은 대표적 종양 샘플을 유동 세포 계측법에 사용될 수있다. 선택적으로,이 관은 4 ° CO 저장 / N 또는 세포 현탁액 (단계 4 참조 - 유세포 염색)로 유세포 염색 직후 분해에 사용될 수있다.
11. 0.5 mm X 0.5 mm의 최대 크기보다 조각 크지로 조직의 나머지 부분을 잘라 극저온로 전송액체 질소에 즉시 냉동을위한 유리 병. 미래 분석 및 공동 목적을 위해 이러한 스냅 냉동 샘플을 사용할 수있다.
    참고 : 직접 접촉은 심각한 부상을 입을 수있는 액체 질소로 작업 할 때 여분의주의를 기울여야합니다. 눈은 측면 방패 또는 얼굴 가리개와 안전 안경을 보호해야합니다. 극저온 장갑도 튀는 직접 접촉에 의한 액체 질소 화상으로부터 보호하기 위해 착용한다. 장갑은 잘 맞지하지만 그들로 빨리해야 액체 질소 시작을 제거 할 수있을만큼 느슨하게해야한다.

4. 유세포 염색

1. 조직의 균질화
   1. DMEM (40 ㎖)의 DNase I (50 U / ml) 및 콜라게나 제 I (2 ㎎ / ㎖)와 소화 매체를 준비한다. 페트리 접시의 뚜껑에 MACS 버퍼에 신선한 또는 O / N 저장된 종양을 배치하고 소화 매체 잠수함.
      주 :. 다른 소화 방법은, 각각의 장점이 존재 (즉, 세포 표면 단백질 EXPression의, 생존). 당신이 원하는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 방법이 있는지 확인하십시오.
   2. 종양이 붙여 넣기 같은 질감을 가질 때까지 외부에서 바늘 접시의 바닥 및 절단에 핀 종양, 메스 중심합니다. 누수를 방지하기 위해 플라스틱 백에 50 ㎖ 튜브, 및 시일 장소 종양 믹스 옮긴다. 인큐베이터에 튜브를 전송하고, 225 RPM, 37 ℃, 1 시간에 회전.
   3. 70μm 셀 스트레이너를 통해 종양 세포 현탁액을 필터. 250 XG, 4 ° C, 5 분 원심 분리기 세포 현탁액. 1 ML의 외과 버퍼 (500 ml의 PBS 1 ml의 0.5 M 재고 EDTA, 10 ML의 FCS 또는 FBS)에 재현 탁 세포 펠렛.
   4. 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × ^{107 세포} / ml의 농도로 다시 중단. 전송 염색에 대한 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 100 μL (10 ⁶ 세포).
2. 생존 및 항체 염색법
   1. 각 생존 얼룩 솔루션의 200 μL를 잘 추가하고 섞는다. Incu어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 대한​​ BATE. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운.
   2. FACS 완충액 200 μL의 표면 항원에 대한 (업체 당) 추천 / 적정 농도로 항체 혼합물을 추가합니다. 어둠 속에서, 4 ° C를 30 분에서 세포를 품어. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운.
   3. , 외과 버퍼의 200 μL로 세척 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. FACS 완충액 200 μL의 세포를 재현 탁하고 수집 및 분석에 대한 흐름 cytometer로 진행합니다.
      참고 : 세포 내 유동 세포 계측법 염색을 수행하는 경우, 단계 4.2.2과 4.2.3 사이의 고정과 투과성으로 단계 및 세포 내 염색을 수행합니다. 사이토 카인 염색법을 수행하는 경우, 셀은 권장 미리 활성화 선행되어야 염색, 모 넨신 및 세포 내 단백질 수송 및 분비 억제제로 활성화 중에 표기수용성 요소의 유지를 보장합니다. 고정 된 세포는 유세포에 어두운 이전에 획득을 4 ° C에서 단기 (일주일)에 저장 될 수있다.

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결과

아래에 표시된 결과는 처리 흑색 종 종양에 대한 광범위한 면역 표현형 유동 세포 계측법 게이팅 전략을 도시한다. 염색의 날, 조직 샘플은 225 RPM의 회전하에 37 ℃에서, 소화 I 콜라게나 제 및 60 분간의 DNase I 인큐베이션 균질화 하였다. 소화 후, 세포 현탁액은 파편을 제거하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 통해 여과하고, 세포를 면역 세포 계측법 표현형에 대한 항체의 형광 표지 된 흐름으로 ...

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토론

궁극적으로, 처리의 방법은 원하는 가설에 의해 결정 (그림 1)을 수행 할 기술적 분석을 예상해야합니다. 다음 섹션에서는 조직 섹션에서 수행 할 수있는 잠재적 인 분석을 설명하는 개요 역할을한다. 그것은 결코 완전한 개요를 의미하지만, 기술을 설명하고 자신의 강점과 약점을 나열하여 가이드 샘플 처리 방법 및 다운 스트림 분석의 선택에 도움을주기위한 것입니다으로하지 않?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needles	BD	305167
Stainless steel disposable scalpels	Miltex	4-410
Tissue culture dish	Corning	353003
Biopsy Cassettes	Thermo Fisher	58931
RNA-stabilizing solution	Ambion	AM7021
1.5 ml Eppendorf tubes	Phenix	MAX-815
50 ml tubes	Corning	430290
10% Neutral Buffered Formalin	StatLab Medical Products	28600-5
Formalin Containers	Fisher Scientific	23-032-059
Optimal cutting temperature solution (OCT)	Sakura Finetek	4583
Tissue-Tek Cryomold	Sakura Finetek	4557
Dnase I	Roche	10104159001
Collagenase I	Roche	11088793001
70μm cell strainers	BD Bioscience	352350
96 well round bottom plates	Corning	3799
Live/Dead stain solution	Life Technologies	L34957