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摘要

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

摘要

在大脑中，大部分的血管系统包括一个选择性屏障，血 - 脑屏障（BBB），调节脑和血液之间的分子和免疫细胞的交换。此外，庞大的神经细胞代谢的需求，需要一个时刻到时刻调节血流量。值得注意的是，这些规定的异常是最脑部病变的病因特点;包括成胶质细胞瘤，中风，水肿，癫痫症，退化性疾病（例如:帕金森氏病，阿尔茨海默氏病），脑肿瘤，以及炎症性疾病，如多发性硬化症，脑膜炎和脓毒症诱导的脑机能障碍。因此，了解的信号传导事件调制脑生理学是一个重大的挑战。多洞察构成该脑血管系统中的各种细胞类型的细胞和分子性质可以从原代培养物或细胞从新鲜分离的脑组织排序来获得。然而，如细胞极性，形态和细胞间的关系属性不保持在这样的准备。我们在这里描述的协议被设计成净化脑血管片段，同时保持结构的完整性。我们表明，隔离容器包括由是由一个连续的基底层包围紧密连接密封内皮细胞。周细胞，平滑肌细胞以及血管周围星形胶质细胞endfeet膜保持连接到内皮细胞层。最后，我们将介绍如何在纯化脑血管进行免疫染色实验。

引言

中枢神经系统（CNS）的正常功能需要一个高度调节细胞外的环境中，以及相对于其他器官1其代谢需求是巨大的。中枢神经系统也是范围广泛的化学品，通常无害的外周器官，但它，神经毒性非常敏感。为确保正常运行，大部分的中枢神经系统"血管形成的血管内皮屏障;血-脑屏障（BBB），其控制分子和离子的流动，以及血液和大脑之间的免疫细胞的通路，从而保持适当的稳态2，也限制了治疗性药物的条目，从而妨碍治疗神经系统疾患3。在细胞水平，血脑屏障主要持续由内皮细胞，流出转运偏振光表达和非常低的胞转率4之间广泛紧密连接。性能及血脑屏障的功能大多是诱发NEighboring细胞4。具体地，周细胞发挥 ​​诱导和维持所述BBB 5,6中起重要作用。作为收缩细胞，周也调节血流量7做周围大血管的平滑肌细胞。最后，星形胶质细胞，脑的主要神经胶质细胞，发送名为endfeet围绕大型进程最大脑脉管8和调制血脑屏障完整性和免疫静止9，代谢物转移到神经元10，和诱导神经元活性之间的紧耦合和血流11,12。

研究脑血管系统的细胞和分子性质的能力是非常重要的特点更好其脑生理学和病理生理学的贡献。为了解决这个问题，已经发展战略，以隔离大脑的脑血管系统，该系统允许完整的脑血管片段的准备。脑血管purification被使用牛脑中13最初描述和改进，并适用于其它物种，特别是啮齿动物14。在这最后的研究中，使用不同大小的过滤器被引入到分离脑血管中，以级分富含不同直径的容器。有趣的是，在这些制剂，内皮细胞保持它们的代谢特性15，转运功能16和17的极化。在这里，我们详细描述了这个协议，并进一步证明了隔离容器保留大部分的原位结构。内皮细胞保持通过紧密连接相连，通过一个连续的基底层包围。周细胞和平滑肌细胞保持附着在内皮细胞层，以及血管周围星形胶质细胞膜。然而，星形胶质细胞，小神经胶质细胞，神经元和少突胶质细胞被消除。最后，我们描述了一个过程来执行免疫染色对离体脑血管。

直至现在大多数关于脑血管系统的分子和细胞研究已经由解离纯化脑血管细胞进行细胞分选使用细胞特异性报道的小鼠品系或免疫染色基于程序18,19。尽管这些技术允许几乎纯脑血管的细胞群的分离，分离的细胞完全丧失其原位形态学和相互作用，这反过来又极大地影响它们的分子和细胞的特性。在这里描述的协议，从而允许整个脑血管片段无需特异性抗体或转基因小鼠的污渍的隔离，提供了一个很好的选择，作为分离的脑血管的总体结构是保守的，因此，减少它们的分子性能影响。隔离容器然后可以用于研究基因的活性，蛋白质合成和调节在所述BBB作为最近描述20,21 。最后，相对于激光捕获显微切割22,23，本协议是廉价的，易于实施，并在任何实验室迅速适应。

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研究方案

1.解决方案和材料

  1. 准备隔离器的解决方案:B1，加1.5毫升HEPES为1M至150ml的HBSS; B2，加3.6克葡聚糖到20ml B1的; B3，加1克的BSA至100毫升B1的。
  2. 通过切割掉底的上旋拧部分修改过滤器保持器。
  3. 制备免疫染色方案:固定溶液，在pH 7.4的PBS的4％多聚甲醛;透/封闭溶液，稀释山羊血清至5％和Triton X100至0.25％的pH 7.4的PBS。
    注意:固定取决于所用第一抗体的类型。

2.解剖

注意:无菌条件不是必需的，除非船舶用于细胞培养的目的。

  1. 准备150毫升的烧杯用20毫升B1的。置于冰上，并用封口膜覆盖，避免空气污染。
  2. 深深麻醉鼠标引擎盖下的小纸巾浸泡在1毫升纯异氟醚被加入Int澳笼。麻醉是由于缺乏反应到足尖捏验证。杀死小鼠颈椎脱位。
    注意:这些步骤都完成符合国家和机构的规定。
  3. 可选:用20毫升的PBS 1X中进行心内灌注，消除血液中的含量24。
  4. 第皮肤从颈部到鼻子手术刀将其拉离。删除所有污染的毛发，用PBS 1X。
  5. 要打开颅骨，先插入剪刀前方的嗅球，并打开剪刀破裂的头骨两部分。
  6. 小心取出用脑铲大脑。解剖出脉络丛从 ​​侧脑室，因为它们会污染血管制剂38。
    注:可选:最后的准备工作将包括实质和脑膜血管。如果不希望的，脑膜可剥离以下由38描述的过程。
  7. TRansfer脑入含冰B1液的烧杯中。多达8个的大脑可以一起处理。

3.脑组织均质

  1. 使用两个解剖刀，在B1的溶液随后获得小块的约2mm手动大力击败大脑。
  2. 均质化制剂用automatized Dounce匀浆，执行20笔在400rpm。确保玻璃管被保持在冰中，该douncer的上部是在溶液中移动时上下，从而防止气穴的形成。如果几个样品制备，每间同质化离子水冲洗douncer。

4.血管净化

  1. 转移匀浆到50ml的塑料管，然后继续离心以2,000rpm离心10分钟，在4℃。一块巨大的白色接口（主要是髓鞘）将形成对血管颗粒（红色的顶部，如果未进行灌注）。
  2. 弃去上清液。该船颗粒和白色的接口将保持连接在一起。加入20毫升冰冷的B2解决方案，手动和大力摇晃管1分钟。
  3. 进入第二离心4400克15分钟，在4℃。髓鞘现在将形成致密的白色层在上清液的表面上。
  4. 仔细保持所述管和缓慢转动它，以允许上清液通过沿着壁分离从管壁髓鞘层。丢弃髓鞘与上清。保持附着在管的底部含有血管沉淀。
  5. 吸干管的内壁与吸收纸缠有5毫升的塑料吸管和除去所有的残余液体，避免触及容器沉淀。保持在一个吸收纸管倒置排出任何剩余的液体。
  6. 移液器向上和向下低结合的技巧，keepi暂停1毫升冰冷的B3解决方案的颗粒纳克管在冰上，再加入另外的5毫升B3的解决方案。确保船只分散尽可能并且不形成聚集体。

5.过滤

  1. 准备在冰上的烧杯用30ml冰冷却的溶液B3。用封口膜覆盖，避免空气污染。
  2. 放置在修改后的过滤器保持器20微米筛网过滤器上的贝克尔烧瓶的顶部并通过施加将10ml冰冷B3溶液平衡。
  3. 倒在过滤器上的船只准备和冲洗容器用40毫升冰冷的B3的解决方案。
  4. 用干净的镊子恢复的过滤器，并立即沉浸在包含B3溶液的烧杯中。通过轻轻晃动松脱，从过滤器的船只。
  5. 倒在50ml塑料管中并离心烧杯内容在2000克5分钟，在4℃。
  6. 注意:可替换地，大脑血管'从步骤4.6的悬浮液可以过滤到一个100微米的网过滤器。在这种情况下，较大的血管优先保留在过滤器上，而流过的包含微血管（主要是毛细血管），其然后在20微米的网过滤器过​​滤如上。
  7. 悬浮微血管的沉淀在1ml冰冷却的溶液B3和吹打它至1.5 ml Eppendorf管中传送它。离心机在2000克5分钟，在4℃。

6.固定，透和阻塞

  1. 转船吹打成0.2毫升含有PBS使用1.0毫升低结合尖端PCR管。注意不要触及容器，因为它们可能会附着在笔尖的外部分。执行双目显微镜下的所有执行下列步骤。
  2. 对于以下每个介质改变，离开管在冰上直到船只已达到的底部，并吸取出来最采用长和东西凝胶加载枪头的液体。
  3. 除去大部分的PBS，并添加200微升固定液。暂停船只通过轻轻摇动孵育20分钟，在室温。
  4. 吸取出固定液，并将其用200μl的1×PBS（第一次洗涤）的替换，孵育5分钟，在室温，重复此步骤3次。每次，验证血管已正确沉到管和移液管出来的1×PBS的底部，确保船只未触及。
  5. 在最后一次洗涤后，更换1×PBS中由透/封闭溶液孵育1小时，在室温，通过轻轻摇动不时重悬血管。

7.免疫染色

  1. 更换透/阻断原发性抗体（在这里看到的和稀释液用在材料模板表的抗体的引用）稀释，在通透/封闭液的混合溶液中，孵育4°CO / N。
  2. 洗涤3次后在PBS中在RT下，孵育第二抗体的混合物在PBS中稀释2小时的船只在RT。
  3. 注:强烈建议进行核染色，用Hoechst（1:2000）:为了区分可能在显微镜下污染的毛或灰尘船（2000一）或DAPI。
  4. 洗涤3次后在PBS中，重悬船只于50μlPBS中。

8.安装和观测

  1. 准备一个尖端硅化玻璃毛细管:用手术刀切P200的枪头和内部调整的毛细血管。毛细管的近似体积为40微升。
  2. 使用硅化玻璃毛细管转移血管载玻片并小心地用一块吸收纸除去液体。
  3. 应用安装中的单滴到血管和保持一个盖玻片在45°使降沿滑的边缘扩散。让熄灭盖玻片，并允许媒体传播缓慢。待其干燥O / N在室温避光。船只可以在一个fluoresc观察耳鼻喉科共聚焦显微镜。

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结果

在这里，我们描述了一种协议，允许为脑血管14的机械隔离。 图1概括了该技术的主要步骤。脑血管的结构是复杂的，并且包括几个细胞类型， 即，由紧密连接密封，并用周细胞，平滑肌细胞，和星形胶质细胞足突9包围内皮细胞。因此，下面的脑血管的隔离，我们的目的是通过如在我们的协议的第二部分中描述的免疫染色的纯化血管的结构表征。集聚蛋白，内?...

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讨论

血 - 脑屏障调节生理物质在中枢神经系统中的进出的通道和保护其不受存在于血液中潜在的有害物质。它参与几个CNS病症，包括神经退行性疾病2和脑肿瘤28。血脑屏障的渗透率极低的也阻碍了靶向神经细胞和方法意欲可逆打开血脑屏障无有害的后果对大脑的研究3一个非常活跃的研究领域的发展的治疗剂的通过。已作出许多努力来开发有价值模型和技术允许细胞，分子和药...

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披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

这项工作是由Labex MemoLife并通过ARSEP支持（倒基金会欧莱雅助手点菜RECHERCHE河畔拉sclérose恩斑）

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Grinder Size CThomas scientific3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
High-performance, Modular StereomicroscopeLeicaMZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000LeicaLED1000
low binding tips (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Borosilicate TubingSutter InstrumentB150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed capThermo ScientificAB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redLife technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Bovine serum albuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
Mounting medium Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100Life technologyI21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547 dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893 dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)SigmaA5971 dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)MilliporeAB9610 dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)Wako019-19741 dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034 dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife technologyA21429 dilution 1:2,000

参考文献

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