Purification de souris vaisseaux cérébraux

Résumé

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Résumé

Dans le cerveau, la majeure partie du système vasculaire est constituée d'une barrière sélective, la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui régule l'échange des molécules et des cellules du système immunitaire entre le cerveau et le sang. En outre, l'énorme demande métabolique neuronale nécessite un règlement d'instant en instant de la circulation sanguine. Notamment, des anomalies de ces réglementations sont les caractéristiques étiologiques de la plupart des pathologies du cerveau; y compris un glioblastome, un accident vasculaire cérébral, l'oedème, l'épilepsie, les maladies dégénératives (ex: la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer), les tumeurs cérébrales, ainsi que des affections inflammatoires telles que la sclérose en plaques, la méningite et dysfonctionnements cérébraux induite par le sepsis. Ainsi, la compréhension des événements de signalisation modulant la physiologie vasculaire cérébral est un défi majeur. Beaucoup de perspicacité dans les propriétés cellulaires et moléculaires des différents types de cellules qui composent le système vasculaire cérébral peut être acquise à partir de la culture ou de la cellule primaire de tri du tissu cérébral fraîchement dissociée. cependant,propriétés telles que la polarité cellulaire, la morphologie et les relations intercellulaires ne sont pas maintenus dans de telles préparations. Le protocole que nous décrivons ici est conçu pour purifier des fragments des vaisseaux du cerveau, tout en maintenant l'intégrité structurelle. Nous montrons que des vaisseaux isolés constitués de cellules endothéliales scellées par des jonctions serrées qui sont entourés par une membrane basale continue. Pericytes, cellules musculaires lisses, ainsi que les astrocytes périvasculaires membranes de endfeet restent attachés à la couche endothéliale. Enfin, nous décrivons comment effectuer des expériences de immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux purifiés.

Introduction

Le bon fonctionnement du système nerveux central (SNC) nécessite un environnement extracellulaire très réglementé, et ses besoins métaboliques sont énormes par rapport à d'autres organes ^1. Le CNS est aussi extrêmement sensibles à un large éventail de produits chimiques, généralement inoffensifs pour les organes périphériques, mais à elle, neurotoxique. Pour assurer un fonctionnement correct, la majeure partie du système vasculaire du SNC »forme une barrière endothéliale; la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui commande l'écoulement des molécules et des ions ainsi que le passage des cellules immunitaires entre le sang et le cerveau, ce qui maintient approprié homéostasie ^2, mais en limitant également l'entrée de médicaments thérapeutiques, les traitements entravant ainsi de troubles neurologiques ^3. Au niveau cellulaire, le BBB est principalement soutenue par de vastes jonctions serrées entre les cellules endothéliales, l'expression polarisée des transporteurs d'efflux et un taux de transcytose très faible ^4. Propriétés et fonctions de la BHE sont essentiellement induites par NEighboring ⁴ cellules. En particulier, les péricytes jouent un rôle important dans l'induction et le maintien de la BHE ^5,6. Être cellules contractiles, péricytes régulent également le flux sanguin ⁷ comme les cellules musculaires lisses entourant les grands navires. Enfin, les astrocytes, les principales cellules gliales du cerveau, envoient de grandes procédés mentionnés endfeet autour de la majeure partie du système vasculaire du cerveau ⁸ et moduler Bureau intégrité et la quiescence immunitaire ^9, le transfert de metabolites de neurones ^10, et induire le couplage étroit entre l'activité neuronale et le flux sanguin ^11,12.

La possibilité d'étudier les propriétés moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral est crucial de mieux caractériser sa contribution à la physiologie du cerveau et de la physiopathologie. Pour aborder cette question, les stratégies visant à isoler le système cérébro-vasculaire du cerveau ont été développées, qui permettent pour la préparation de fragments des vaisseaux du cerveau intactes. Cerebral navire purification a d'abord été décrite en utilisant les encéphales ^{13 et} améliorée et adaptée à d'autres espèces, en particulier les rongeurs ^14. Dans cette dernière étude, l'utilisation de filtres de taille variable a été introduit pour séparer les vaisseaux cérébraux pour des fractions enrichies dans des récipients de diamètres différents. Fait intéressant, dans ces préparations, les cellules endothéliales ont gardé leurs propriétés métaboliques ^15, la fonctionnalité de transporteur et de polarisation ^{16 17.} Ici, nous décrivons en détail ce protocole et démontrent en outre que les navires isolés conservent la plupart de leur dans les structures in situ. Les cellules endotheliales restent liés par des jonctions serrées et entourés par une membrane basale continue. Péricytes et les cellules musculaires lisses restent attachés à la couche endothéliale, ainsi que des membranes d'astrocytes périvasculaires. Cependant, les astrocytes, les cellules de la microglie, les neurones et les oligodendrocytes sont éliminés. Enfin, nous décrivons une procédure pour effectuer immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux isolés.

Jusqu'à présent, la plupart des études moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral concernant ont été effectués sur les cellules des vaisseaux cérébraux purifiés dissociées en utilisant des souches de souris journaliste cellulaires spécifiques ou des procédures sur la base de ^18,19 immunocoloration-tri cellulaire. Bien que ces techniques permettent l'isolement de populations de cellules vasculaires cérébraux presque purs, des cellules isolées perdent totalement leur morphologie in situ et les interactions, qui à son tour, affecte grandement leurs propriétés moléculaires et cellulaires. Le protocole décrit ici, ce qui permet l'isolement de fragments cérébrovasculaires entières sans avoir besoin d'anticorps spécifiques ou les taches de souris transgéniques, offre une bonne alternative comme la structure globale des vaisseaux cérébraux isolés est conservée, ainsi, de diminuer répercussions sur leurs propriétés moléculaires. Vaisseaux isolés pourraient ensuite être utilisés pour l'étude de l'activité des gènes, la synthèse des protéines et de la réglementation à la BBB comme récemment décrit ^20,21 . Enfin, par rapport à microdissection laser ^22,23 Le présent Protocole est peu coûteux, facile à réaliser et rapidement adaptable pour tout laboratoire.

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Protocole

1. Les solutions et matériaux

1. Préparer des solutions de navires d'isolement: B1, ajouter 1,5 ml de HEPES 1M à 150 ml de HBSS; B2, ajouter 3,6 g de dextrane à 20 ml de B1; B3, ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de B1.
2. Modifier le porte-filtre en coupant le fond de la partie supérieure de vissage.
3. Préparer des solutions de immunocoloration: solution de fixation, 4% de paraformaldehyde dans PBS pH 7,4; Perméabilisation / solution de blocage, diluer du sérum de chèvre à 5% de Triton X100 et à 0,25% dans du PBS pH 7,4.
   Remarque: La fixation dépend du type d'anticorps primaires utilisés.

2. Dissection

Nota: Des conditions stériles ne sont pas nécessaires, à moins que les navires sont utilisés à des fins de culture de cellules.

1. Préparer un bêcher de 150 ml avec 20 ml de B1. Garder sur la glace et couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l'air.
2. Profondément anesthésier la souris sous une capuche avec une petite serviette de papier trempé dans 1 ml d'isoflurane pur qui est int ajoutéso la cage. L'anesthésie est vérifiée par l'absence de réaction à un pincement de l'orteil. Tuez la souris par dislocation cervicale.
   Remarque: Ces étapes sont réalisées en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles.
3. Facultatif: Procédez perfusion intracardiaque avec 20 ml de PBS 1x pour éliminer le contenu de sang ^24.
4. Section de la peau avec un scalpel à partir du cou au nez et retirez. Retirer tous les poils contaminantes avec PBS 1x.
5. Pour ouvrir le crâne, d'abord insérer des ciseaux en avant vers le bulbe olfactif, et ouvrir les ciseaux pour rompre le crâne en deux parties.
6. Retirez délicatement le cerveau à l'aide d'une spatule de cerveau. Disséquer les plexus choroïde des ventricules latéraux comme ils contaminer le vaisseau sanguin préparation ^38.
   NOTE: En option: La préparation finale contiendra parenchyme et les méninges navires. Dans le cas contraire on le souhaite, des méninges peuvent être décollée suivant le mode opératoire décrit par ^38.
7. Transfert le cerveau dans le bécher contenant une solution de B1 sur la glace. Jusqu'à 8 cerveaux peuvent être traités ensemble.

3. Homogénéisation des tissus du cerveau

1. L'utilisation de deux scalpels, manuellement et battre vigoureusement le cerveau dans la solution de B1 par la suite l'obtention de petits morceaux d'environ 2 mm.
2. Homogénéiser la préparation avec un homogénéisateur Dounce automatisée, effectuant 20 coups à 400 tpm. Assurez-vous que le tube de verre est maintenue dans de la glace et que la partie supérieure de la douncer est en solution lors du déplacement de haut en bas, de manière à éviter la formation de poches d'air. Si plusieurs échantillons sont préparés, lavez la douncer avec de l'eau ionisée entre chaque homogénéisation.

Purification 4. navire

1. Transfert de l'homogénat dans un tube en plastique de 50 ml et procéder à la centrifugation à 2000 g pendant 10 min à 4 ° C. Une grande interface blanche (la plupart du temps de la myéline) se forme sur le dessus de la pastille de la cuve (rouge si aucune perfusion a été effectuée).
2. Jeter le surnageant. Le culot de la cuve et l'interface blanc resteront attachés ensemble. Ajouter 20 ml de solution de B2 glacée et agiter le tube manuellement et vigoureusement pendant 1 min.
3. Passez à la deuxième centrifugation à 4400 g pendant 15 min à 4 ° C. La myéline va maintenant former une couche blanche dense à la surface du surnageant.
4. Détacher soigneusement la couche de myéline des parois du tube en tenant le tube et le faisant tourner lentement pour permettre au surnageant de passer le long des parois. Jeter la myéline avec le surnageant. Le culot contenant les vaisseaux reste attaché au fond du tube.
5. Tamponnez la paroi intérieure du tube avec un papier absorbant enroulé autour d'un 5 ml en plastique pipette et retirer tous les fluides résiduels, évitez de toucher le culot de navire. Garder le tube à l'envers sur un papier absorbant pour drainer tout liquide restant.
6. Suspendre le culot dans 1 ml de solution de B3 glacée par pipetage de haut en bas avec des pointes à faible liaison, keeping le tube sur la glace, puis ajouter encore 5 ml de solution de B3. Assurez-vous que les navires sont dispersés autant que possible et ne forment pas d'agrégats.

5. Filtration

1. Préparer un bêcher sur de la glace avec 30 ml d'une solution d'B3 glacée. Couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l'air.
2. Placer un filtre à mailles de 20 um sur un porte-filtre modifié sur le sommet d'un flacon de Becker et équilibrer en appliquant 10 ml de solution d'B3 glacée.
3. Verser la préparation de la cuve du filtre et rincer les récipients avec 40 ml de solution d'B3 glacée.
4. Récupérer le filtre à l'aide des pinces propres et plonger immédiatement dans le bêcher contenant la solution de B3. Détachez les navires de la filtre en le secouant doucement.
5. Verser le contenu du bêcher dans un tube en plastique de 50 ml et on centrifuge à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.
6. Note: Alternativement, la suspension par les vaisseaux du cerveau de l'étape 4.6 peut être filtré sur un filtre de 100 um mesh.Dans ce cas, les grands navires sont préférentiellement retenues sur le filtre tandis que le flux continu contient microvaisseaux (principalement capillaires), qui sont ensuite filtrés sur un filtre de 20 um mesh comme ci-dessus.
7. Reprendre le culot de microvaisseaux dans 1 ml de solution de B3 glacée et le transférer à la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.

6. Fixation, Perméabilisation et le blocage

1. Les navires de transfert par pipetage dans 0,2 ml tubes PCR contenant du PBS en utilisant un 1,0 ml faible pointe de liaison. Veillez à ne pas toucher les navires, car ils peuvent adhérer à la partie extérieure de la pointe. Effectuez toutes les étapes suivantes sous un microscope binoculaire.
2. Pour chacune des modifications moyennes suivantes, laisser les tubes sur la glace jusqu'à ce que les navires ont atteint le fond, et la pipette sur la plupart des liquides en utilisant les embouts de pipettes gel chargement longs et chose.
3. Retirer la plupart des PBS et ajouter 200 ul de solution de fixation.Suspendre les navires en agitant doucement et incuber pendant 20 min à température ambiante.
4. Introduire à la pipette sur la solution de fixateur et le remplacer avec 200 pi de PBS 1x (premier lavage), incuber pendant 5 min à température ambiante et répétez cette étape 3 fois. Chaque fois, vérifier que les navires ont correctement coulé au fond des tubes et pipettes sur PBS 1x, assurant que les navires ne sont pas touchés.
5. Après le dernier lavage, remplacer 1x PBS par le / la solution de blocage de perméabilisation et incuber 1 heure à température ambiante, la remise en suspension des vaisseaux en secouant délicatement de temps en temps.

7. Immunocoloration

1. Remplacer la solution de perméabilisation / blocage avec le mélange d'anticorps primaires (voir les références des anticorps utilisés ici et dilutions dans les matériaux modèle de tableau) dilué dans le / la solution de blocage de perméabilisation, et incuber à 4 ° CO / N.
2. Après 3 lavages en PBS à la température ambiante, incuber les vaisseaux avec le mélange d'anticorps secondaire dilué dans du PBS pendant 2 heuresà la température ambiante.
3. Remarque: nous vous recommandons vivement d'effectuer une coloration nucléaire avec Hoechst (1: 2000) ou DAPI (1: 2000) afin de distinguer les navires de contaminants possible poils ou de poussières sous le microscope.
4. Après 3 lavages dans du PBS, remettre en suspension les récipients dans 50 ul de PBS.

8. Montage et Observation

1. Préparer une pointe avec un capillaire de verre siliconé: couper une pointe de pipette P200 aide d'un scalpel et d'ajuster le capillaire à l'intérieur. Le volume approximatif du capillaire est de 40 ul.
2. Transférer les navires sur une lame de verre à l'aide du capillaire de verre siliconé et retirer délicatement le liquide avec un morceau de papier absorbant.
3. Appliquer une seule goutte de milieu de montage sur les navires et maintenez une lamelle à 45º permettant la baisse de répandre le long du bord de la barbotine. Laissez aller au large de la lamelle et laisser moyen de se propager lentement. Laissez sécher O / N à la température ambiante à l'abri de la lumière. Les navires peuvent être observées sous un Déessent microscope confocal.

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Résultats

Ici, nous décrivons un protocole permettant l'isolation mécanique des vaisseaux du cerveau ^14. La figure 1 résume les principales étapes de cette technique. L'architecture des vaisseaux cérébraux est complexe et comprend plusieurs types de cellules, à savoir, les cellules endotheliales scellées par des jonctions serrées et les pericytes, entourés par les cellules musculaires lisses, et les procédés pour les pieds ⁹ astrocyte. Ainsi, suite à l&...

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Discussion

La barrière hémato-encéphalique régule le passage de substances physiologiques dans et hors du système nerveux central et le protège contre des substances potentiellement nocives présentes dans le sang. Elle intervient dans plusieurs pathologies du système nerveux central, incluant les maladies neurodégénératives ^{2 et 28} tumeurs du cerveau. Le très faible perméabilité de la BHE entrave également le passage d'agents thérapeutiques ciblant les cellules neuronales et le développement de mét...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Grinder Size C	Thomas scientific	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000	Leica	LED1000
low binding tips (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk	Millipore	SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Microscope Slides	Thermo Scientific	1014356290F
Cover Slips, Thickness 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap	Thermo Scientific	AB-0266
PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
10x PBS	Euromedex	ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma	14533
Mounting medium Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400	kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)	Sigma	A2547	dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)	Sigma	G3893	dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)	Sigma	A5971	dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)	BD Biosciences	610061	dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)	Millipore	AB9610	dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)	provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.	dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)	Wako	019-19741	dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A11029	dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life technology	A11034	dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A21424	dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life technology	A21429	dilution 1:2,000