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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Zusammenfassung

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Einleitung

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen 1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS 'Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase 2 beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen 3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate 4 aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB 5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung 7 als die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß 8 und modulieren BBB Integrität und Immun quiescence 9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen 10 und induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung 11,12.

Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne 13 beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren 14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften 15, Transporter Funktionen 16 und 17 Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße.

Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren 18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 20,21 . Schließlich, im Vergleich zu Laser Mikrodissektion 22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

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Protokoll

1. Lösungen und Materialien

  1. Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1.
  2. Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil.
  3. Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4.
    Anmerkung: Die Fixierung ist abhängig von der Art der primären Antikörper verwendet.

2. Dissection

Anmerkung: Sterile Bedingungen nicht erforderlich ist, es sei denn, Schiffe für Zellkulturzwecke verwendet.

  1. Bereiten ein 150 ml Becherglas mit 20 ml B1. Halten Sie auf dem Eis geben und mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Die Maus tief betäuben unter einer Haube mit einer kleinen Papiertuch in 1 ml reinem Isofluran, die int hinzugefügt wird eingeweichto den Käfig. Anästhesie wird durch eine fehlende Reaktion auf eine Zehe pinch verifiziert. Tötet die Maus durch Genickbruch.
    Hinweis: Diese Schritte werden in Übereinstimmung mit nationalen und institutionellen Regelungen durchgeführt.
  3. Optional: intrakardiale Perfusion mit 20 ml PBS 1x, die Blut-Gehalt 24 zu eliminieren.
  4. § die Haut mit einem Skalpell aus dem Hals auf die Nase und ziehen Sie sie. Entfernen Sie alle verunreinigenden Haare mit PBS 1x.
  5. Um den Schädel zu öffnen, erste Schereneinsatz nach vorn, um den Riechkolben, und öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile brechen.
  6. Das Gehirn mit einem Hirn Spachtel vorsichtig entfernen. Präparieren Sie die Plexus choroideus der Seitenventrikel, wie sie das Blutgefäß Vorbereitung 38 kontaminieren würde.
    HINWEIS: Optional: Die letzten Vorbereitungen werden parenchymalen und Hirnhäute Gefäße enthalten. Wenn nicht gewünscht wird, kann im Anschluss an die Meningen off von 38 beschriebene Verfahren abgezogen werden.
  7. Transfer das Gehirn in das Becherglas mit B1-Lösung auf Eis. Bis zu 8 Köpfe zusammen behandelt werden.

3. Gehirngewebe Homogenisierung

  1. Mit Hilfe von zwei Skalpelle, manuell und kräftig zu schlagen, das Gehirn in der B1-Lösung anschließend Erhalt kleine Stücke von etwa 2 mm.
  2. Homogenisieren, die Vorbereitung mit einem automatisierten Dounce Homogenisator, die Durchführung 20 Hübe bei 400 Umdrehungen pro Minute. Sicherzustellen, dass die Glasröhre wird in Eis und dass der obere Teil des douncer in Lösung ist, wenn und ab bewegt, um so die Bildung von Lufttaschen zu verhindern, gehalten. Wenn mehrere Proben hergestellt, waschen Sie die douncer mit ionisiertem Wasser zwischen jeder Homogenisierung.

4. Vessel Reinigung

  1. Übertragen des Homogenisats in einen 50-ml-Kunststoffrohr und gehen in die Zentrifugation bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C. Eine große weiße Schnittstelle (meist Myelin), werden am oberen Ende des Behälters Pellet (Rot bilden, wenn keine Perfusion erfolgte).
  2. Überstand verwerfen. Das Gefäß und das Pellet weiß Schnittstelle miteinander verbunden bleiben. In 20 ml eiskaltem B2-Lösung und manuell und kräftig schütteln Sie das Röhrchen 1 min.
  3. Verfahren zur zweiten Zentrifugation bei 4.400 g für 15 min bei 4 ° C. Das Myelin wird nun eine dichte weiße Schicht auf der Oberfläche des Überstandes.
  4. Vorsichtig abziehen der Myelinschicht von den Rohrwänden durch Halten des Rohres und langsam drehen, damit der Überstand, um an den Wänden bestehen. Verwerfen Myelin mit dem Überstand. Das Pellet, das die Gefäße bleibt an der Unterseite des Rohres angebracht ist.
  5. Tupfen Sie die Innenwand des Rohres mit einem saugfähigen Papier um eine 5 ml Plastikpipette eingewickelt und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten und berühren nicht die Gefäß Pellet. Halten Sie das Röhrchen kopfüber auf ein saugfähiges Papier um Restflüssigkeiten zu entleeren.
  6. Hängen Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem B3-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mit Low-Bindung Tipps, keeping die Röhrchen auf Eis, fügen Sie dann weitere 5 ml B3-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Schiffe sind so weit wie möglich verteilt und keine Aggregate bilden.

5. Filtration

  1. Bereiten Sie ein Becherglas auf Eis mit 30 ml eiskaltem B3-Lösung. Deckel mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Legen Sie eine 20 & mgr; m-Sieb-Filter auf einer modifizierten Filterhalter auf der Spitze eines becker Kolben und ins Gleichgewicht, indem 10 ml eiskaltem B3-Lösung.
  3. Gießen Sie das Gefäß Vorbereitung auf dem Filter und spülen Sie die Gefäße mit 40 ml eiskaltem B3-Lösung.
  4. Recover den Filter mit sauberer Pinzette und sofort eintauchen in das Becherglas mit dem B3-Lösung. Trennen Sie die Geräte vom Filter von ihr leichtes Schütteln.
  5. Gießen des Bechers Gehalt in einem 50 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.
  6. Hinweis: Alternativ können die Hirngefäße "Suspension aus Schritt 4.6 auf eine 100 & mgr; m-Sieb-Filter gefiltert werden.In diesem Fall werden größere Gefäße vorzugsweise auf dem Filter zurückgehalten, während die Durchfluss enthält Mikrogefßen (hauptsächlich Kapillaren), die dann auf einem 20 & mgr; m-Mesh-Filter, wie oben filtriert werden.
  7. Das Pellet von Mikrogefäßen in 1 ml eiskaltem B3-Lösung und überträgt es durch Pipettieren es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.

6. Fixierung, Permeabilisierung und Blocking

  1. Transfer Gefäße durch Pipettieren in 0,2 ml PCR-Röhrchen mit PBS unter Verwendung einer 1,0 ml geringe Bindungsspitze. Darauf achten, nicht zu berühren die Gefäße, da sie nach außen Teil der Spitze halten. Führen Sie alle folgenden Schritte unter einem Binokular.
  2. Für jede der folgenden Mediums ändert, lassen Sie die Röhrchen auf Eis, bis die Schiffe haben den Boden erreicht, und Pipetten die meisten der Flüssigkeiten mit langen und etwas Gel-Loading-Pipettenspitzen.
  3. Entfernen Sie die meisten der PBS und fügen Sie 200 ul der Fixierlösung.Suspend die Gefäße durch leichtes Schütteln und Inkubation für 20 min bei RT.
  4. Pipettieren Sie die Fixierungslösung und ersetzen Sie es mit 200 ul 1x PBS (erste Wäsche), Inkubation für 5 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. Jedes Mal, wenn Sie sicher, dass Schiffe, korrekt auf den Boden der Röhrchen und Pipette aus 1x PBS versenkt, wodurch die Behälter nicht berührt.
  5. Nach dem letzten Wasch ersetzen 1x PBS durch die Permeabilisierung / Blockierlösung und Inkubation 1 h bei RT, Resuspendieren der Schiffe, die von sanft von Zeit zu Zeit schütteln.

7. Immunfärbung

  1. Ersetzen Sie die Permeabilisierung / Blocking-Lösung mit der Mischung aus primären Antikörpern (siehe Referenzen der in der Materialvorlage Tabelle verwendet und Verdünnungen Antikörper) in der Permeabilisierung / Blockierlösung verdünnt, und Inkubation bei 4 ° CO / N.
  2. Nach 3 Waschschritten in PBS bei RT inkubieren die Gefäße mit der Mischung aus Sekundärantikörper in PBS für 2 Stunden verdünntbei RT.
  3. Hinweis: Wir empfehlen dringend, Kernfärbung mit Hoechst (1: 2.000) oder DAPI (1: 2000), um die Schiffe vor möglichen verunreinigenden Haare oder Staub unter dem Mikroskop zu unterscheiden.
  4. Nach 3 Waschungen in PBS, Resuspendieren der Gefäße in 50 ul PBS.

8. Montage und Beobachtung

  1. Bereiten Sie eine Spitze mit einem silikonisierten Glaskapillare: schneiden Sie ein P200 Pipettenspitze mit einem Skalpell und stellen Sie die Kapillare im Inneren. Das ungefähre Volumen der Kapillare 40 ul.
  2. Übertragen Sie die Schiffe auf einem Glasobjektträger mit dem silikonisierten Glaskapillare und entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück saugfähigem Papier.
  3. Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf die Schiffe, und halten Sie ein Deckglas bei 45 ° so dass der Tropfen, um entlang der Kante der Schlupf zu verbreiten. Lassen Sie aus dem Deckglas und lassen mittel- bis langsam ausbreiten. Lassen Sie es trocken O / N bei RT unter Lichtschutz. Schiffe unter einer fluoreszier beobachtenent konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße dur...

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Diskussion

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen 2 und Hirntumoren 28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Labex MemoLife und durch die ARSEP unterstützt (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en Plaques)

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Grinder Size CThomas scientific3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
High-performance, Modular StereomicroscopeLeicaMZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000LeicaLED1000
low binding tips (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Borosilicate TubingSutter InstrumentB150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed capThermo ScientificAB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redLife technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Bovine serum albuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
Mounting medium Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100Life technologyI21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547 dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893 dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)SigmaA5971 dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)MilliporeAB9610 dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)Wako019-19741 dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034 dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife technologyA21429 dilution 1:2,000

Referenzen

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

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