マウス脳血管の精製

要約

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

要約

脳内、血管系の大部分は、選択的障壁から成り、脳と血液との間の分子および免疫細胞の交換を調節する血液脳関門（BBB）。また、巨大なニューロンの代謝要求は、血流のその時々の規制が必要です。注目すべきは、これらの規制の異常が最も脳の病理の病原特徴です。 、脳腫瘍、ならびに、多発性硬化症、髄膜炎、および敗血症によって誘発される脳機能障害のような炎症状態：神経膠芽腫、脳梗塞、浮腫、てんかん、変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病例）を含みます。このように、脳血管生理機能を調節するシグナル伝達事象を理解することは大きな課題です。脳血管系を構成する種々の細胞型の細胞および分子の性質に非常に洞察を新たに分離した脳組織から選別初代培養または細胞から得ることができます。しかし、このような細胞極性、形態や細胞間の関係のような特性は、このような製剤中で維持されていません。ここで説明するプロトコルは、構造的完全性を維持しながら、脳血管断片を精製するために設計されています。我々は、単離された血管が連続基底膜で囲まれているタイトジャンクショ​​ンで封止された内皮細胞から構成されていることを示しています。周皮細胞、平滑筋細胞ならびに血管周囲のアストロサイトのエンドフィートの膜は、内皮層に付着したままです。最後に、精製された脳血管に免疫染色実験を実行する方法について説明します。

概要

中枢神経系（CNS）の適切な機能は、高度に調節された細胞外環境を必要とし、その代謝要求は、他の臓器¹に比べて巨大です。 CNSはまた、一般的に末梢器官に無害それに、神経毒性の化学物質の広い範囲、に非常に敏感です。正しい機能を保証するために、CNS「血管系のほとんどは、内皮障壁を形成します。分子およびイオンの流れ、並びに、血液と脳の間の免疫細胞の通過を制御する血液脳関門（BBB）は、このようにして治療を妨げ、それによって適切な²ホメオスタシス^{を維持する}だけでなく、治療薬の侵入を制限します神経疾患の^3。細胞レベルでは、BBBは、主に内皮細胞、排出トランスポーターの偏発現と非常に低いトランスサイトーシス率⁴との間に大規模なタイトジャンクションによって維持されます。 BBBの性質や機能は、主にNEによって誘導されますighboring細胞^4。具体的には、周皮細胞は、BBB ^5,6を誘導し、維持する上で重要な役割を果たしています。大血管の周囲の平滑筋細胞がそうであるように、収縮された細胞、周皮細胞は、血液の流れ^{7を制御します} 。最後に、アストロサイト、脳の主要なグリア細胞、脳血管系⁸のほとんどの周りにエンドフィートという名前の大きなプロセスを送信し、BBBの完全性と免疫静止^{9を調節し} 、ニューロン¹⁰の代謝物の転送、および神経活動の間に緊密な結合を誘導し、血流^11,12。

脳血管系の分子や細胞の性質を研究する能力は、脳生理学や生理病理への貢献をより良く特徴付けることが重要です。この質問に取り組むためには、脳の脳血管系を隔離するための戦略は、無傷の脳血管フラグメントの調製を可能にする、開発されています。脳血管Purificationは当初、特にげっ歯類¹⁴で、他の種にウシ脳^13を用いて説明し、改善し、適応させました。この最後の研究では、様々なサイズのフィルターの使用は、異なる直径の容器内で濃縮画分に脳血管を分離するために導入されました。興味深いことに、このような製剤には、内皮細胞は、それらの代謝特性^15、トランスポーターの機能¹⁶と、偏光^{17を保ちました。}ここでは、具体的に、このプロトコルを記述し、さらに単離血管が自分の中でその場構造のほとんどを維持することを示しています。内皮細胞は、タイトジャンクショ​​ンによってリンクされ、連続的な基底膜に囲まれたままです。周皮細胞および平滑筋細胞、内皮層、ならびに血管周囲の星状細胞膜に付着したままです。しかし、アストロサイト、ミクログリア細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトが排除されます。最後に、我々は、単離された脳血管に免疫染色を行うための手順を説明します。

これまで脳血管系に関わる分子および細胞研究のほとんどは、細胞選別細胞特異的レポーターマウス系統または免疫染色に基づく手順^{18,19を使用して}精製した解離脳血管細胞上で行われています。これらの技術は、ほぼ純粋な脳血管細胞集団の単離のために可能にするが、単離された細胞は、完全に順番に、非常にそれらの分子や細胞の特性に影響を与える彼らのその場での形態との相互作用を、失います。分離された脳血管の全体的な構造は、それらの分子特性に影響を小さく、したがって、保存されているとして、ここで説明されたプロトコルは、特異的な抗体またはトランスジェニックマウスの汚れの必要のない全脳血管の断片を単離を可能にする、優れた代替手段を提供しています。最近^20,21に記載のように単離された容器は、その後BBBにおける遺伝子活性、タンパク質合成および調節を研究するために使用されるかもしれません。最後に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション^22,23と比較して、本発明のプロトコルは、安価で実行が容易で、任意の研究室に急速に適応可能です。

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プロトコル

1.ソリューションと材料

1. 分離容器の溶液を調製する：B1、HBSSの150ミリリットルにHEPES 1M、1.5mlのを追加します。 B2、B1の20ミリリットルにデキストラン3.6gのを追加します。 B3は、B1の100mlに、BSAの1グラムを追加します。
2. 上部のネジ止め部分から下部を切断してフィルターホルダーを変更します。
3. 免疫染色ソリューション準備：固定液、pH7.4のPBS中4％パラホルムアルデヒドを、透過処理は、/ブロッキング溶液、5％にヤギ血清を希釈し、pH7.4のPBS中の0.25％のトリトンX100。
   注意：固定は、用いた一次抗体の種類によって異なります。

2.解剖

注意：容器は、細胞培養のために使用されていない限り、滅菌条件は、必要とされません。

1. B1の20mlで150ミリリットルのビーカーを用意します。氷上に保ち、空気汚染を避けるために、パラフィルムでカバーしています。
2. 深くint型を追加された純粋なイソフルランの1ミリリットルに浸した小さな紙タオルでボンネットの下にマウスを麻酔ケージO。麻酔は、つま先のピンチに反応の欠如によって確認されました。頸椎脱臼によりマウスを殺します。
   注：これらの手順は、国家や機関の規制に準拠して達成されます。
3. オプション：血液^{コンテンツ} 24 ^{を除去するために} 、PBS 1×20mlで心臓内灌流を行います。
4. 第鼻に首からメスで皮膚と離れてそれを引っ張ります。 PBS 1Xを持つすべての汚染毛を削除します。
5. 頭蓋骨を開くには、最初の嗅球に前方にはさみを入れ、2つの部分で頭蓋骨を破壊するはさみを開きます。
6. 慎重に脳へらを使って脳を削除してください。彼らは血管の準備^38を汚染するよう側脳室から脈絡叢を解剖。
   注：オプション：最終製剤は実質および髄膜血管を含んでいます。望まれていない場合、髄膜³⁸によって記載された手順に従って剥離することができます。
7. Trの氷上B1溶液を含有するビーカーに脳をansfer。最大8脳を一緒に処理することができます。

3.脳組織の均質化

1. その後、約2mmの小片を取得B1溶液中で脳を破っ手動で、激しく、2メスを使用しました。
2. 400 rpmで20ストロークを行う、自動化さダウンスホモジナイザーで準備を均質化。エアポケットの形成を防止するように、ガラス管を氷中に維持されると、上下移動時にdouncerの上部が溶液中にあることを確認します。いくつかのサンプルが用意されている場合は、それぞれの均質化の間にイオン水でdouncerを洗います。

4.船の精製

1. 50ミリリットルのプラスチックチューブにホモジネートを移し、4℃で10分間2000グラムで遠心分離に進みます。何の灌流を行わなかった場合は大きな白いインタフェース（主にミエリン）を容器ペレット（赤の上に形成することになります）。
2. 上清を捨てます。容器ペレットと白のインターフェイスが一緒に付着したままになります。氷冷B2溶液20mlを加え、1分間手で激しくチューブを振ります。
3. 4℃で15分間4400グラムで2回目の遠心分離に進みます。ミエリンは、現在上清の表面に高密度の白色層を形成します。
4. 慎重にチューブを保持し、ゆっくり上清を壁に沿って通過させるためにそれを回転させることにより、チューブ壁からミエリン層を切り離します。上清とミエリンを捨てます。血管を含むペレットは、チューブの底に付着したままです。
5. 5ミリリットルのプラスチックピペットに巻き付け吸収紙でチューブの内壁をブロットおよびすべての残留流体を除去、血管ペレットを触れないように注意してください。残りの液体を排出するために吸収紙の上にチューブ逆さまにしてください。
6. 低結合ヒントをピペッティングにより氷冷B3溶液1mlでペレットを中断し、keepiチューブを氷上にngのは、B3液の別の5ミリリットルを追加します。船を極力分散され、凝集体を形成しないことを確認します。

5.ろ過

1. 氷冷B3液30mlで氷の上でビーカーを準備します。空気汚染を避けるためにパラフィルムでカバー。
2. ベッカーフラスコの上に修正されたフィルターホルダーに20ミクロンメッシュフィルターを配置し、氷冷B3溶液10mlを適用することにより平衡化。
3. フィルター上の容器の準備を注ぎ、氷冷B3液40mlで血管をすすぎます。
4. きれいなピンセットを使用してフィルタを回復し、すぐB3液の入ったビーカーの中に浸します。軽く振ることによってフィルターから血管を外します。
5. 4℃で5分間、2,000×gで50 mlのプラスチックチューブと遠心分離機でビーカーの内容を注ぎます。
6. 注：または、ステップ4.6からの脳船舶の懸濁液を100ミクロンメッシュフィルターに濾過することができます。フロースルーは、次いで、上記のように20μmのメッシュのフィルターで濾過された微小血管（主として毛細血管）を含むが、この場合には、より大きな血管が優先フィルター上に保持されます。
7. 氷冷B3溶液1mlに微小血管のペレットを再懸濁し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれをピペッティングすることにより、それを転送します。 4℃で5分間2000グラムで遠心。

6.固定、透過処理およびブロッキング

1. 1.0ミリリットル低い結合チップを用いて、PBSを含む0.2ミリリットルのPCRチューブにピペット操作による転送船。彼らは先端の外側の部分に付着し得るような血管を触れないように注意してください。双眼顕微鏡下で、次のすべての手順を実行します。
2. 以下の培地の変更ごとに、血管が底に到達するまで氷上にチューブを残して、長い事ゲルローディングピペットチップを使用して液体のほとんどをピペット。
3. PBSの大部分を除去し、固定溶液の200μlを添加します。軽く振ることによって血管を一時停止し、室温で20分間インキュベートします。
4. 固定溶液をピペット1×PBS（第一洗浄）を200μlと交換し、室温で5分間インキュベートし、この手順を3回繰り返します。たびに、血管が正常血管が触れていない保証し、1×PBSアウトチューブ、ピペットの底に沈んでいることを確認してください。
5. 最後の洗浄後、随時穏やかに振とうすることにより、血管を再懸濁、透過処理/ブロッキング溶液によって1×PBSを交換し、室温で1時間インキュベートします。

7.免疫染色

1. 透過化/ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体（材料テンプレートテーブルでここと希釈液を用いた抗体の参考文献を参照）が混在する透過処理/ブロッキング溶液を交換し、4°CO / Nでインキュベートします。
2. 室温でPBS中で3回洗浄した後、2時間PBS中に希釈した二次抗体の混合物で血管をインキュベートRTで。
3. 注意：顕微鏡下で毛や埃の混入可能性から血管を区別するために：（2000 1）またはDAPI：私たちは強くヘキスト（2000 1）で核染色を行うお勧めします。
4. PBS中で3回洗浄した後、PBSを50μlの血管を再懸濁します。

8.取り付けと観測

1. シリコン処理ガラスキャピラリーで先端を準備します。メスを用いてP200のピペットチップをカットし、内部の毛細血管を調整します。キャピラリーのおおよその量は40μLです。
2. シリコン処理ガラスキャピラリーを用いてガラススライドに船を移し、慎重に吸収紙の切れ端で液体を除去します。
3. 船の上に封入剤の一滴を適用し、ドロップがスリップの縁に沿って拡散することを可能にする45°でカバーガラスを保持します。カバースリップをオフに行ってみようと媒体がゆっくりと広がりを可能にします。それ乾燥したO / N室温で光から保護してみましょう。容器はfluoresc下で観察することができENT共焦点顕微鏡。

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結果

ここでは、脳血管¹⁴の機械的な分離を可能にするプロトコルを記述している。 図1は、この技術の主な手順をまとめたものです。脳血管の構造は複雑であり、いくつかの細胞型を含む、すなわち、内皮細胞のタイトジャンクションによって密封され、周皮細胞、平滑筋細胞、および星状細胞の足突起⁹によって囲ま。このように、脳血管の単離後、私たちは?...

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ディスカッション

血液脳関門は、CNSの中と外の生理学的物質の通過を調節し、血液中に存在する潜在的に有害な物質に対してそれを保護します。これは、神経変性疾患²と脳腫瘍²⁸を含む、いくつかの中枢神経系の病態に関与しています。 BBBの極めて低い透過性はまた、神経細胞を標的治療薬の通過妨げと可逆的に脳のための有害な結果を伴うBBBを開くしようとする方法の開発は、研究³

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Grinder Size C	Thomas scientific	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000	Leica	LED1000
low binding tips (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk	Millipore	SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Microscope Slides	Thermo Scientific	1014356290F
Cover Slips, Thickness 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap	Thermo Scientific	AB-0266
PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
10x PBS	Euromedex	ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma	14533
Mounting medium Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400	kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)	Sigma	A2547	dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)	Sigma	G3893	dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)	Sigma	A5971	dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)	BD Biosciences	610061	dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)	Millipore	AB9610	dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)	provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.	dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)	Wako	019-19741	dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A11029	dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life technology	A11034	dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A21424	dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life technology	A21429	dilution 1:2,000