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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

Nel cervello, la maggior parte del sistema vascolare costituito da una barriera selettiva, la barriera emato-encefalica (BBB) ​​che regola lo scambio di molecole e cellule immunitarie tra il cervello e il sangue. Inoltre, la grande richiesta metabolica neuronale richiede un regolamento momento per momento del flusso sanguigno. In particolare, le anomalie di questi regolamenti sono le caratteristiche distintive eziologici della maggior parte delle patologie cerebrali; compresi glioblastoma, ictus, edema, epilessia, malattie degenerative (es: la malattia di Parkinson, il morbo di Alzheimer), tumori cerebrali, così come le condizioni infiammatorie come la sclerosi multipla, la meningite e sepsi indotta disfunzioni cerebrali. Pertanto, la comprensione degli eventi di segnalazione che modulano la fisiologia cerebrale è una sfida importante. Molto comprensione delle proprietà cellulari e molecolari dei vari tipi di cellule che compongono il sistema cerebrovascolare può essere acquisita da coltura primaria o separazione delle cellule dal tessuto cerebrale di recente dissociato. Però,proprietà come polarità cellulare, morfologia e rapporti intercellulari non sono mantenuti in tali preparazioni. Il protocollo che descriviamo qui è concepito per purificare frammenti dei vasi cerebrali, mantenendo l'integrità strutturale. Abbiamo dimostrato che i vasi isolati costituiti da cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette che sono circondati da una lamina basale continuo. Periciti, cellule muscolari lisce e le membrane astrociti endfeet perivascolari rimangono attaccati allo strato endoteliale. Infine, si descrive come eseguire gli esperimenti di immunoistochimica sui vasi cerebrali purificate.

Introduzione

Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (CNS) richiede un ambiente extracellulare altamente regolato, e le sue richieste metaboliche sono enormi rispetto ad altri organi 1. Il CNS è anche estremamente sensibile a una vasta gamma di prodotti chimici, generalmente innocui agli organi periferici, ma ad esso, neurotossico. Per un corretto funzionamento, la maggior parte del 'vascolare CNS costituisce una barriera endoteliale; la barriera emato-encefalica (BBB), che controlla il flusso di molecole e ioni così come il passaggio di cellule immunitarie tra il sangue e il cervello, mantenendo quindi una corretta omeostasi 2, ma anche limitando l'ingresso di farmaci terapeutici, trattamenti ostacolano pertanto di disturbi neurologici 3. A livello cellulare, il BBB è sostenuta principalmente da ampi giunzioni strette tra le cellule endoteliali, espressione polarizzata dei trasportatori di efflusso e un tasso molto basso transcitosi 4. Proprietà e funzioni del BBB sono per lo più indotte da NEcellule ighboring 4. In particolare, periciti svolgono un ruolo importante nel indurre e mantenere la BBB 5,6. Essendo le cellule contrattili, periciti regolano anche il flusso di sangue 7 come le cellule della muscolatura liscia che circondano i grandi vasi. Infine, astrociti, le principali cellule gliali del cervello, inviano grandi processi denominati endfeet intorno la maggior parte del sistema vascolare cerebrale 8 e modulare l'integrità BBB e quiescenza immunitario 9, il trasferimento di metaboliti di neuroni 10, e indurre l'accoppiamento stretto tra l'attività neuronale e il flusso di sangue 11,12.

La possibilità di studiare le proprietà molecolari e cellulari del sistema cerebrovascolare è fondamentale per caratterizzare meglio il suo contributo alla fisiologia del cervello e fisiopatologia. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate strategie per isolare il sistema cerebrovascolare del cervello, che consentono per la preparazione di frammenti dei vasi cerebrali intatti. Cerebral nave purification è stata inizialmente descritta utilizzando cervelli bovini 13 e migliorato e adattato ad altre specie, in particolare roditori 14. In questo ultimo studio, l'uso di filtri di varie dimensioni è stato introdotto per separare vasi cerebrali in per frazioni arricchite in vasi di diametri diversi. È interessante notare che, in tali preparati, le cellule endoteliali mantenuto le loro proprietà metaboliche 15, funzionalità trasportatore 16 e 17 di polarizzazione. Qui, descriviamo in dettaglio questo protocollo e inoltre dimostrare che le navi isolate mantengono la maggior parte di loro in strutture in situ. Le cellule endoteliali restano legati da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continuo. Periciti e cellule muscolari lisce rimangono attaccati allo strato endoteliale, così come membrane astrociti perivascolari. Tuttavia, astrociti, cellule microgliali, neuroni e oligodendrociti sono eliminati. Infine, si descrive una procedura per eseguire immunocolorazione sui vasi cerebrali isolate.

Fino ad ora la maggior parte degli studi molecolari e cellulari riguardanti il sistema cerebrovascolare sono stati eseguiti su cellule dei vasi cerebrali purificate dissociati da cellule di smistamento utilizzando cellulari specifici ceppi di topi giornalista o procedure basate immunocolorazione-18,19. Sebbene queste tecniche consente l'isolamento delle popolazioni cellulari quasi puro cerebrovascolari, cellule isolate perdono completamente la loro morfologia e in situ interazioni, che a sua volta, influisce notevolmente le loro proprietà molecolari e cellulari. Il protocollo qui descritto, consentendo l'isolamento di interi frammenti cerebrovascolari senza necessità di anticorpi specifici o macchie di topi transgenici, offre una buona alternativa come la struttura complessiva di isolati vasi cerebrali è conservato, quindi, diminuendo ripercussioni sulla loro proprietà molecolari. Isolato imbarcazioni potrebbero quindi essere utilizzati per studiare l'attività dei geni, la sintesi proteica e la regolamentazione a BBB come recentemente descritto 20,21 . Infine, rispetto alla cattura microdissezione laser 22,23 il presente protocollo è poco costoso, facile da eseguire e rapidamente adattabile a qualsiasi laboratorio.

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Protocollo

1. Soluzioni e materiali

  1. Preparare le soluzioni di isolamento dei vasi: B1, aggiungere 1,5 ml di HEPES 1M a 150 ml di HBSS; B2, aggiungere 3,6 g di destrano al 20 ml di B1; B3, aggiungere 1 g di BSA a 100 ml di B1.
  2. Modificare il portafiltro tagliando il fondo al largo della parte superiore avvitamento.
  3. Preparare le soluzioni di immunoistochimica: soluzione di fissaggio, 4% paraformaldeide in PBS pH 7,4; Permeabilization / soluzione bloccante, diluire siero di capra al 5% e Triton X100 al 0,25% in PBS pH 7,4.
    Nota: Fixation dipende dal tipo di anticorpi primari utilizzati.

2. Dissection

Nota: le condizioni sterili non sono richieste, a meno che le navi sono utilizzati per scopi di colture cellulari.

  1. Preparare un bicchiere da 150 ml con 20 ml di B1. Continuate a ghiaccio e coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
  2. Profondamente anestetizzare il mouse sotto una cappa con un piccolo asciugamano di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano puro che viene aggiunto into la gabbia. L'anestesia è verificata da una mancanza di reazione ad una presa punta. Uccidere il mouse dislocazione cervicale.
    NOTA: Questi passaggi sono realizzate nel rispetto della normativa nazionale e istituzionale.
  3. Opzionale: eseguire perfusione intracardiaca con 20 ml di PBS 1x per eliminare il contenuto del sangue 24.
  4. Sezione la pelle con un bisturi dal collo al naso e tirarlo via. Rimuovere tutti i peli contaminanti con PBS 1x.
  5. Per aprire il cranio, prima inserire forbici anteriormente al bulbo olfattivo, e aprire le forbici per rompere il cranio in due parti.
  6. Rimuovere con attenzione il cervello con una spatola cerebrale. Sezionare plessi corioidei dei ventricoli laterali come sarebbero contaminare il sangue di preparazione nave 38.
    NOTA: Opzionale: La preparazione finale conterrà vasi parenchimali e le meningi. Se non si desidera, le meningi possono essere staccata seguendo la procedura descritta da 38.
  7. Transfer cervello nel becher contenente soluzione B1 su ghiaccio. Fino a 8 cervelli possono essere trattati insieme.

3. tessuto cerebrale omogeneizzazione

  1. Utilizzando due bisturi, manualmente e vigorosamente battere il cervello nella soluzione B1 ottenere successivamente pezzetti di circa 2 mm.
  2. Omogeneizzare preparato, con un Dounce omogeneizzatore automatizzata, l'esecuzione di 20 colpi a 400 rpm. Assicurarsi che il tubo di vetro è mantenuto in ghiaccio e che la parte superiore del douncer è in soluzione quando si spostano su e giù, in modo da impedire la formazione di sacche d'aria. Se diversi campioni sono preparati, lavare il douncer con acqua ionizzata tra ogni omogeneizzazione.

4. Vessel Purificazione

  1. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di plastica da 50 ml e procedere alla centrifugazione a 2.000 g per 10 min a 4 ° C. Un grande interfaccia bianca (principalmente mielina) formerà sulla parte superiore del serbatoio pellet (rosso se è stata eseguita alcuna perfusione).
  2. Scartare il surnatante. Il pellet nave e l'interfaccia bianco rimarrà attaccato insieme. Aggiungere 20 ml di soluzione B2 ghiacciata e agitare il tubo manualmente e vigorosamente per 1 min.
  3. Procedere alla seconda centrifugazione a 4.400 g per 15 minuti a 4 ° C. La mielina ora formare uno strato bianco densa alla superficie del supernatante.
  4. Staccare accuratamente lo strato mielina dalle pareti del tubo tenendo il tubo e ruotare lentamente per permettere il surnatante di passare lungo le pareti. Eliminare mielina con il surnatante. Il pellet contenente i vasi rimane attaccato al fondo della provetta.
  5. Tamponare la parete interna del tubo con carta assorbente avvolto intorno ad un pipetta da 5 ml e rimuovere tutti i residui di liquido, evitare di toccare il pellet recipiente. Tenere il tubo capovolto su una carta assorbente per drenare eventuali residui di liquido.
  6. Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata pipettando su e giù con punte basso vincolante, keeping la provetta in ghiaccio, quindi aggiungere altri 5 ml di soluzione B3. Assicurarsi che le navi sono disperse, per quanto possibile e non formano aggregati.

5. Filtrazione

  1. Preparare un becher su ghiaccio con 30 ml di soluzione B3 ghiacciata. Coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
  2. Collocare un filtro da 20 micron a maglia su un portafiltro modificato sulla sommità di un pallone becker ed equilibrare applicando 10 ml di soluzione B3 ghiacciata.
  3. Versate la preparazione nave sul filtro e sciacquare i vasi con 40 ml di soluzione B3 ghiacciata.
  4. Recuperare il filtro con pinze pulite e immergere immediatamente nel bicchiere contenente la soluzione B3. Staccare i vasi dal filtro scuotendolo delicatamente.
  5. Versare il contenuto becher in un tubo di plastica da 50 ml e centrifugare a 2000 g per 5 minuti a 4 ° C.
  6. Nota: in alternativa, la sospensione dei vasi cerebrali 'dal punto 4.6 può essere filtrata su un filtro a maglie micron 100.In questo caso, più grandi vasi sono preferenzialmente trattenuta dal filtro mentre il flow-through contiene microvasi (principalmente capillari), che vengono poi filtrati su un filtro 20 micron a maglie come sopra.
  7. Risospendere il pellet di microvasi in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata e trasferirlo pipettando in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Centrifugare a 2.000 g per 5 minuti a 4 ° C.

6. Fissazione, permeabilizzazione e blocco

  1. Vasi di trasferimento pipettando nella 0,2 ml provette PCR contenenti PBS usando una bassa punta vincolante 1,0 ml. Fare attenzione a non toccare i vasi in quanto potrebbero aderire alla parte esterna della punta. Eseguire le seguenti operazioni al microscopio binoculare.
  2. Per ciascuno dei seguenti cambiamenti medi, lasciare i tubi in ghiaccio fino vasi hanno raggiunto il fondo, e pipettare la maggior parte dei liquidi con puntali gel-caricamento lunghi e cosa.
  3. Eliminare la maggior parte PBS e aggiungere 200 ml di soluzione di fissativo.Sospendere i vasi agitando delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  4. Pipettare la soluzione fissativo e sostituirlo con 200 ml di PBS 1x (primo lavaggio), incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere l'operazione 3 volte. Ogni volta, verificare che le navi sono affondate correttamente al fondo delle provette e pipetta su PBS 1x, assicurando le navi non sono toccati.
  5. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire PBS 1x dal / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione e incubare 1 ora a temperatura ambiente, risospendere i vasi agitando delicatamente di tanto in tanto.

7. Immunostaining

  1. Sostituire la / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione con il mix di anticorpi primari (vedi riferimenti degli anticorpi utilizzati qui e diluizioni nella tabella modello Materials) diluito in / soluzione di blocco permeabilizzazione, e incubare a 4 ° CO / N.
  2. Dopo 3 lavaggi in PBS a temperatura ambiente, incubare le navi con il mix di anticorpi secondari diluito in PBS per 2 orea RT.
  3. Nota: si consiglia vivamente di eseguire una colorazione nucleare con Hoechst (1: 2.000) o DAPI (1: 2.000), al fine di distinguere le navi di possibile contaminazione peli o polveri sotto il microscopio.
  4. Dopo 3 lavaggi in PBS, risospendere le navi in ​​50 ml di PBS.

8. Montaggio e di osservazione

  1. Preparare una punta con un capillare di vetro siliconato: tagliare una punta di pipetta P200 con un bisturi e regolare il capillare all'interno. Il volume approssimativo del capillare è di 40 microlitri.
  2. Trasferire le navi ad un vetrino utilizzando il capillare di vetro siliconato e rimuovere con attenzione il liquido con un pezzo di carta assorbente.
  3. Applicare una sola goccia di soluzione di montaggio sulle navi e in possesso di un vetrino a 45 ° permettendo al calo di diffusione lungo il bordo dello slip. Lasciate andare la vetrino e lasciare medio di diffondersi lentamente. Lasciare asciugare O / N a RT con protezione dalla luce. Le navi possono essere osservati sotto un flmicroscopio confocale ent.

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Risultati

Qui, descriviamo un protocollo che consente l'isolamento meccanico dei vasi cerebrali 14. La figura 1 riassume le fasi principali di questa tecnica. L'architettura dei vasi cerebrali è complesso e comprende vari tipi di cellule, cioè, cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati da periciti, cellule muscolari lisce e processi piede astrociti 9. Così, dopo l'isolamento dei vasi cerebrali, abbiamo voluto caratterizzare la struttura dei vasi ...

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Discussione

La barriera ematoencefalica regola il passaggio di sostanze fisiologiche dentro e fuori del sistema nervoso centrale e lo protegge da sostanze potenzialmente nocivi presenti nel sangue. E 'coinvolto in diverse patologie del sistema nervoso centrale, tra cui le malattie neurodegenerative 2 e tumori cerebrali 28. La bassissima permeabilità della BBB ostacola anche il passaggio di agenti terapeutici mirati cellule neurali e lo sviluppo di metodi che intendono aprire reversibilmente BBB senza cons...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal LABEX MemoLife e dal ARSEP (Fondazione per l'aide à la recherche sur la sclérose en placche)

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Grinder Size CThomas scientific3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
High-performance, Modular StereomicroscopeLeicaMZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000LeicaLED1000
low binding tips (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Borosilicate TubingSutter InstrumentB150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed capThermo ScientificAB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redLife technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Bovine serum albuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
Mounting medium Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100Life technologyI21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547 dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893 dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)SigmaA5971 dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)MilliporeAB9610 dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)Wako019-19741 dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034 dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife technologyA21429 dilution 1:2,000

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