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Resumen

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Resumen

En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.

Introducción

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del 'vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada 2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos 3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis 4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring 4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB 5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo 7 al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro 8 y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune 9, la transferencia de metabolitos a las neuronas 10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre 11,12.

La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos 13 y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores 14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas 15, funcionalidad transportador 16 y 17 de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas.

Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción 18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente 20,21 . Por último, en comparación con láser captura microdissection 22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.

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Protocolo

1. Soluciones y Materiales

  1. Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1.
  2. Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado.
  3. Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5% y Triton X100 al 0,25% en PBS pH 7,4.
    Nota: La fijación depende del tipo de anticuerpos primarios utilizados.

2. Disección

Nota: No se requieren condiciones estériles, a menos que los buques se utilizan para fines de cultivo celular.

  1. Preparar un vaso de precipitados de 150 ml con 20 ml de B1. Mantenga en hielo y cubrir con parafilm para evitar la contaminación del aire.
  2. Profundamente anestesiar el ratón bajo una campana con una pequeña toalla de papel empapado en 1 ml de isoflurano pura que se añade into la jaula. La anestesia se verifica por la falta de reacción a una pizca dedo del pie. Matar el ratón por dislocación cervical.
    NOTA: Estos pasos se llevan a cabo de conformidad con las normas nacionales e institucionales.
  3. Opcional: Realice la perfusión intracardíaca con 20 ml de PBS 1x para eliminar el contenido de sangre 24.
  4. Sección de la piel con un bisturí desde el cuello hasta la nariz y tirar a la basura. Retire todos los pelos que contaminan con PBS 1x.
  5. Para abrir el cráneo, primero insertar tijeras anteriormente hasta el bulbo olfatorio, y abrir las tijeras para romper el cráneo en dos partes.
  6. Retire con cuidado el cerebro usando una espátula de cerebro. Diseccionar el plexo coroideo de los ventrículos laterales, ya que contaminarían la preparación de los vasos sanguíneos 38.
    NOTA: Opcional: La preparación final contendrá los vasos del parénquima y meninges. Si no se desea, meninges puede despegarse siguiendo el procedimiento descrito por 38.
  7. Transfer el cerebro en el vaso de precipitados que contiene la solución B1 en hielo. Hasta 8 cerebros pueden tratarse juntos.

3. Cerebro Tejido Homogeneización

  1. El uso de dos escalpelos, manualmente y vigorosamente vencieron el cerebro en la solución B1 posteriormente la obtención de pequeñas piezas de aproximadamente 2 mm.
  2. Homogeneizar la preparación con un homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Asegúrese de que el tubo de vidrio se mantiene en hielo y que la parte superior de la douncer está en solución cuando se mueve arriba y abajo, a fin de evitar la formación de bolsas de aire. Si se preparan varias muestras, se lava la douncer con agua desionizada entre cada homogeneización.

Purificación 4. Recipiente

  1. Transferir el homogeneizado en un tubo de plástico de 50 ml y proceder a la centrifugación a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Una gran interfaz blanco (en su mayoría de mielina) se forma en la parte superior de la pastilla recipiente (rojo si no se realizó la perfusión).
  2. Eliminar el sobrenadante. El sedimento de buque y la interfaz blanco permanecerá unida juntos. Añadir 20 ml de solución B2 enfriado con hielo y agitar el tubo de forma manual y vigorosamente durante 1 min.
  3. Proceder a la segunda centrifugación a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. La mielina ahora formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante.
  4. Separar con cuidado la capa de mielina de las paredes del tubo manteniendo el tubo y lentamente girar para permitir que el sobrenadante a pasar a lo largo de las paredes. Desechar la mielina con el sobrenadante. El sedimento que contiene los vasos permanece unido en la parte inferior del tubo.
  5. Seque la pared interior del tubo con un papel absorbente envuelto alrededor de una pipeta de plástico 5 ml y eliminar todos los fluidos residuales, evite tocar el pellet buque. Mantenga el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para drenar cualquier líquido restante.
  6. Suspender el sedimento en 1 ml de solución B3 helada pipeteando arriba y abajo con las puntas de baja unión, keeping el tubo en hielo, a continuación, añadir otros 5 ml de solución B3. Asegúrese de que los buques se dispersan tanto como sea posible y no forman agregados.

5. Filtración

  1. Preparar un vaso de precipitados sobre hielo con 30 ml de solución de B3 enfriado con hielo. Cubra con parafilm para evitar la contaminación del aire.
  2. Colocar un filtro de 20 micras de malla en un soporte de filtro modificado en la parte superior de un matraz de Becker y equilibrar mediante la aplicación de 10 ml de solución B3 enfriado con hielo.
  3. Verter la preparación recipiente en el filtro y enjuagar los vasos con 40 ml de solución de B3 enfriado con hielo.
  4. Recuperar el filtro utilizando pinzas limpias e inmediatamente sumerja en el vaso que contiene la solución B3. Separe los buques del filtro sacudiéndolo suavemente.
  5. Verter el contenido vaso de precipitados en un tubo de plástico 50 ml y centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.
  6. Nota: Como alternativa, la suspensión de los vasos cerebrales 'desde el paso 4.6 se puede filtrar sobre un filtro de 100 micras de malla.En este caso, los buques más grandes se retienen preferentemente en el filtro, mientras que el flujo a través de los microvasos (principalmente contiene capilares), que luego se filtró en un filtro de 20 micras de malla como anteriormente.
  7. Resuspender el sedimento de microvasos en 1 ml de solución B3 enfriado con hielo y transferirlo pipeteando en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.

6. La fijación, permeabilización y el bloqueo

  1. Vasos de transferencia transfiriendo al vaso 0,2 ml tubos de PCR que contienen PBS utilizando una punta de unión de baja de 1,0 ml. Tener cuidado de no tocar los vasos, ya que pueden adherirse a la parte exterior de la punta. Realice todos los siguientes pasos bajo un microscopio binocular.
  2. Para cada uno de los siguientes cambios de medio, deje los tubos en hielo hasta que los barcos han llegado a la parte inferior, y la pipeta a cabo la mayor parte de los líquidos utilizando largas y cosa puntas de pipeta de gel de carga.
  3. Retire la mayor parte del PBS y añadir 200 l de solución de fijación.Suspender los vasos agitando suavemente y se incuba durante 20 min a TA.
  4. Pipetear la solución de fijación y reemplazarlo con 200 l de PBS 1x (primer lavado), se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y repita este paso 3 veces. Cada vez, compruebe que los barcos se han hundido correctamente a la parte inferior de los tubos y la pipeta fuera 1x PBS, asegurando los buques no se tocan.
  5. Después del último lavado, reemplace 1x PBS por la solución de permeabilización / bloqueo y se incuba 1 hora a RT, la resuspensión de los vasos agitando suavemente de vez en cuando.

7. La inmunotinción

  1. Vuelva a colocar la solución de permeabilización / bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios (véanse las referencias de los anticuerpos utilizados aquí y diluciones en la tabla de plantilla de Materiales) diluido en la solución de permeabilización / bloqueo, y se incuba a 4 ° CO / N.
  2. Después de 3 lavados en PBS a temperatura ambiente, se incuban los vasos con la mezcla de anticuerpos secundarios diluido en PBS durante 2 horasa TA.
  3. Nota: le recomendamos realizar la tinción nuclear con Hoechst (1: 2000) o DAPI (1: 2000) con el fin de distinguir los vasos de posibles contaminantes pelos o polvo en el microscopio.
  4. Después de 3 lavados en PBS, resuspender los vasos en 50 l de PBS.

8. Montaje y Observación

  1. Preparar una punta con un capilar de vidrio siliconado: cortar una punta de pipeta P200 utilizando un bisturí y ajustar el capilar interior. El volumen aproximado del capilar es de 40 l.
  2. La transferencia de los buques a un portaobjetos de vidrio utilizando el capilar de vidrio siliconado y retirar con cuidado el líquido con un trozo de papel absorbente.
  3. Aplique una gota de medio de montaje en los vasos y mantenga un cubreobjetos a 45º permitiendo la caída se extienda a lo largo del borde de la hoja. Deje que se apaga el cubreobjetos y deje a medio y se extendió lentamente. Deje que se seca O / N a temperatura ambiente con la protección de la luz. Los buques se pueden observar bajo un colgmicroscopio confocal ent.

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Resultados

Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetiv...

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Discusión

La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Grinder Size CThomas scientific3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
High-performance, Modular StereomicroscopeLeicaMZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000LeicaLED1000
low binding tips (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Borosilicate TubingSutter InstrumentB150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed capThermo ScientificAB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redLife technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Bovine serum albuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
Mounting medium Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100Life technologyI21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547 dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893 dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)SigmaA5971 dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)MilliporeAB9610 dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)Wako019-19741 dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034 dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife technologyA21429 dilution 1:2,000

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