Cortex-，Hippocampus-，Thalamus-，下丘脑 - ，横向隔核 - 纹状体专用<em&gt;在子宫内</em&gt;电穿孔的C57BL / 6小鼠

摘要

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

摘要

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

引言

自2001年第一次描述由三个独立的小组^1-3 I N 子宫内的电已成为在啮齿动物中枢神经系统的分析基因表达的一种广泛使用的标准工具。相比一代基因敲除小鼠，这是，尽管不断提高技术，还有时间和金钱消耗，对在子宫内电由于其简单的呼吁。 所以 ，在子宫内的电实现了快速，高效的GAIN-和丧失功能的研究^4。

转染脑区，包含带负电荷的质粒的溶液注入到心室。在电脉冲，带负电荷的DNA迁移朝向正极，因此，转染的区域可以通过改变阳极的位置简单地选择。它经常被显示，对中枢神经系统的许多区域可たrgeted ^3,5-8。例如，最近的研究表明，海马，梨状皮层或纹状体^9-11的特定转染。然而，关于适当的位置的信息往往只是很少标准化，并不总是容易转移到不同的小鼠品系。

某些萌芽阶段的转染是远离琐碎。当选择在子宫内的电的集式为特定的许多影响因素必须考虑。首先，以最佳转染各自胚胎阶段，知识适当的电压是必要的。高电压降低存活率，而低电压降低转染效率^2,3,12。另外，电极桨的大小起着至关重要的作用，因为采用太大的效果降低特异性或可导致死亡是由于心脏节律^4,12,13亲情电极桨。该应用电压的大小和电极桨的位置是要考虑的最重要的特征，但也有影响电穿孔的结果，等的DNA的溶液的施加量进一步的因素。

我们已经制定了详细的协议，它使C57BL / 6小鼠¹²的各个脑区的快速，高效的转染。在此要使用的协议有关的电压的详细信息，并设置在电极焊盘以增强特异性的大小。此外，关于心室信息要与用于质粒溶液的量和电极的位置的建议被供给填充的沿。在地图，这些位置的进一步可视化的详细位置信息的指示使简单的具体和有效的 retrosplenial皮层，运动皮层，躯体感觉皮层，梨状皮质，T的子宫内的电他CORNU ammonis 1-3，齿状回，纹状体，外侧隔核，丘脑和下丘脑。

研究方案

伦理声明:小鼠和实验程序的处理被根据用于动物护理欧洲，国内和机构准则进行。

1.在子宫内的电

注: 在子宫内的电进行以前发表^12,14。因此，该方法仅在下面的（图1）简单说明。

1. 准备工作
   1. 制备坚牢绿色无内毒素的先进染同类的质粒（含有1,5- pCAGGS中）溶液如前所述^12。
   2. 拉和研磨（35°角），硼硅玻璃毛细管（直径0.8-0.9）注射。
   3. 消毒仪器。
2. 手术
   1. 在开始手术前施用镇痛剂（卡洛芬，4毫克/公斤体重，SC，24小时，仓库）至少30分钟。
   2. 保持的长度麻醉到最多35-45分钟（第三阶段-外科麻醉的阶段根据Guedel ¹⁵ -最大25-30分钟）。
   3. 麻醉超时孕鼠异氟醚（诱导室:2.8％，经手术口罩:2.5％）。确认麻醉由无反应到脚趾捏。
   4. 应用眼膏，以防止在麻醉过程中眼睛干燥。
   5. 消毒用7.5％Providone碘溶液手术区并覆盖鼠标用无菌纱布（湿润用0.9％苄醇的盐水溶液）与仅暴露手术区。
   6. 切割用解剖刀打开腹腔（皮肤切口:1.5-2厘米，肌肉切口:1-1.5厘米）。
   7. 保留从干燥通过用温热0.9％苄醇的盐溶液或其它无菌等渗溶液润湿的指示兽医人员或委员会打开腹腔。
   8. 轻轻取出子宫角（使用环钳，不要触摸手指子宫S）。
3. 注射DNA和电穿孔。注:具体细节定位特定的区域显示在第2节。
   1. 经由制备的硼硅酸盐毛细管中图1和部分2指示的有色DNA溶液进入心室缓缓注入。
   2. 通过专门的钳型铂电极（间隔周期长度为50毫秒，间歇暂停950毫秒）应用适当的电压对应的萌芽阶段（例如，36-38 V代表E14）。电压的施加期间脉冲电穿孔桨叶，以尽量减少子宫壁的损伤。
4. 帖子电/术后护理
   1. 在腹腔内仔细替换子宫角。
   2. 缝合肌肉和皮肤切口分开。
   3. 让我们恢复一热支持设备上的鼠标休息。
   4. 监督恢复过程中鼠标（行为，饲料水消耗量），4小时，24小时和手术后48小时。如果需要的话，应用额外的镇痛药（卡洛芬，4毫克/公斤体重，24小时，仓库），用于进一步2天。

2.转染特异性脑区

注意:正极的位置被示出为通过填充有DNA溶液（右或第三脑室）和正极的位置的心室的垂直中心线之间的角度。当填充左心室中的位置是镜像反转。 图 4中的耳原始的位置被示出，这提供了重要的参考点。

1. 的皮层区转染（图2A，表1）。
   1. 如在1.2节进行手术。对于在子宫内电穿孔皮质区域使用E14的胚胎。
   2. 注入1.5-2微升含4微克的DNA在右侧脑室DNA的溶液通过准备硼硅毛细血管。
      1. 小心地用卵圆钳，以便有没有明显的血管穿刺部位上方的位置胚。
      2. 慢慢注入DNA的溶液从人字缝线约0.75毫米冠状和0.5毫米的横向从矢状缝（图3）。确保插入深度为1.2毫米（E14，从子宫壁测得）。检查用锋利的划分蓝绿色彩。
   3. 通过应用专门钳型铂电极上的电压（间隔周期长度为50毫秒，间歇暂停950毫秒）。
      1. 使用3mm或5mm电极桨。
      2. 使用电压范围从36-38 V.
      3. 放置电极只是前耳原基的中心。
      4. 从330-0°染retrosplenial皮质使用的角度，转染运动皮层0-40°，转染躯体感觉皮层40-95°，转染梨状皮质95-110°（ 图2A）。
   4. 如第1.4节所述执行后电/术后护理。牺牲小鼠并按照第3条所述电（E18）后分析胚胎4天。
2. 转染海马（图2B，表1）的。
   1. 如在1.2节进行手术。对于在子宫内的电海马结构的使用E15胚胎。
   2. 注入2微升含4微克的DNA在右侧脑室经由制备的硼硅酸盐毛细管DNA的溶液。
   3. 通过应用专门钳型铂电极上的电压（间隔周期长度为50毫秒，间歇暂停950毫秒）。
      1. 使用3mm或5mm电极桨。
      2. 使用电压范围为38-40。
      3. 放置负极只是前耳原基的中心和中心O˚F在耳边原基的中间正极。
      4. 转染齿状回使用的角度从190-210°，转染大角ammonis（CA）3 210-230°，转染CA2 230-250°，转染CA1 250-275°（ 图2B）。
   4. 如第1.4节所述执行后电/术后护理。如在第3节中所述执行后，完整的海马结构（出生后，P21）分析。
3. 横向隔核和纹状体的转染（图2C，表1）
   注:角度与转染海马重叠。为了有效地转染的横向隔核和没有令人不快的海马染早期胚胎阶段（E12）纹状体必须被使用。
   1. 如在1.2节进行手术。对于在子宫内的电外侧隔核和striat的UM使用E12的胚胎。
   2. 注入1微升含有4微克的DNA在右侧脑室经由制备的硼硅酸盐毛细管DNA的溶液。
   3. 通过应用专门钳型铂电极上的电压（间隔周期长度为50毫秒，间歇暂停950毫秒）。
      1. 使用一个0.5毫米的电极。
      2. 使用33 V.
      3. 放置电极的中心在耳边原基的水平。
      4. 从100-170°染横向隔核使用的角度，以转染纹状体170-240°（ 图2C）。
   4. 如第1.4节所述执行后电/术后护理。牺牲小鼠并按照第3条所述电（E18）后分析胚胎6天。
4. 丘脑和下丘脑的转染（图2D，表1）
   1. 如在1.2节进行手术。对于在ü泰罗电丘脑和下丘脑使用E12-E13的胚胎。
   2. 注入含4微克的DNA在侧脑室（左或右）通过制备硼硅毛细管1-1.5微升DNA的溶液。等待2-3分钟，直到溶液扩散进入第三脑室。可替代地直接注入到第三脑室。
      注意:这增强的特异性，但可能会导致降低的存活率（损坏的高风险）。
   3. 通过应用专门钳型铂电极上的电压（间隔周期长度为50毫秒，间歇暂停950毫秒）。
      1. 使用一个0.5或3mm电极。
      2. 使用电压范围为33〜35 V.
      3. 将电极的中心仅后路耳原基。
      4. 以从25-40°染丘脑使用角度，以转染下丘脑90-180°（图2D）。
   4. 执行后电/术后护理作为DEScribed在1.4节。牺牲小鼠并按照第3条所述电（E18）后分析胚胎6天。

3.灌注固定

1. 准备工作
   1. 温暖的4％多聚甲醛（PFA）至37℃。
   2. 填在50ml的注射器用PBS（4℃）和第二注射器用温热的PFA。避免气泡。
   3. 注射器连接到一个三路活塞。第三端连接到翼输液器（蝴蝶）。
   4. 冲洗翅输液器，用PBS。
2. 灌注
   1. 深麻醉小鼠（怀孕或产后转）与盐酸氯胺酮皮下应用（60毫克/千克）和赛拉嗪（7.5毫克/千克）。
   2. 经确认为无反应脚趾捏了手术耐受阶段。
   3. 打开腹腔只是肋骨之下。
   4. 小心切割膜片。
   5. 小心地通过一个位于E剖开胸腔ACH网站到锁骨。
   6. 将蝴蝶的尖端插入左侧心脏室（从心脏的顶点开始）。
   7. 切开左心耳。
   8. 慢慢灌注小鼠用PBS（约10毫升）中。
   9. 切换活塞三路。
   10. 灌注鼠标5-10毫升4％的煤灰。
   11. 用剪刀斩首鼠标和解剖大脑开始在枕骨大孔。由于此前公布的¹⁶下进行清扫。
   12. Postfixate大脑对于在4％PFA 2天。保持大脑在4℃下在黑暗中。

4.免疫组化

1. 产生70微米的部分（例如，用一个vibratome）。
2. 可选:增强荧光抗体染色。
   1. 阻塞在RT 1小时的部分（0.1-0.2％的Triton X-100，5％正常山羊血清）
   2. 孵育O / N与合适的抗体（抗GFP，1:1000）
   3. 洗3-5倍用0.1M磷酸盐缓冲液中。
   4. 孵育3-5小时用适当的荧光缀合的第二抗体（的Alexa Fluor 488缀合的抗兔IgG抗体，1:1000）。
   5. 择:（在0.1M磷酸盐缓冲液的DAPI，0.2微克/毫升）染液4-6-diaminodino -2-苯基1分钟。
   6. 用适当的荧光显微镜分析荧光。

结果

图2 显示了发展成为retrosplenial皮层区域的子宫内的电示例，具体的，运动皮层，躯体感觉皮层，梨状皮质，大角ammonis 1-3，齿状回，纹状体，外侧隔核，丘脑和下丘脑。该转染的结果示旁边的推荐角度（ 图2）。为更好地可视化在体内角度的电极（0.5毫米）的位置也示于胚胎（图5，胚胎在子宫内 ，胚胎在羊膜囊，解剖胚胎）。为了...

讨论

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV