Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Özet

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Özet

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Giriş

Üç bağımsız gruplar ^1-3 2001 yılında ilk açıklama beri i n utero elektroporasyon kemirgen, merkezi sinir sisteminde gen ifadesini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan standart bir araç haline gelmiştir. Sürekli gelişen teknikler, hala zaman ve para kolaylığından dolayı, rahimde elektroporasyon temyiz tüketen rağmen bir nakavt farelerin nesil ile karşılaştırıldığında. Yani, in utero elektroporasyon hızlı ve verimli gain- ve zarar-fonksiyon çalışmalarını ⁴ sağlar.

Serebral bölgeleri transfekte etmek için, negatif yüklü plasmid ihtiva eden bir çözelti, ventrikül içine enjekte edilir. Elektrik akımının sırasında, negatif yüklü DNA pozitif kutbuna doğru hareket eder ve bu nedenle, transfekte edilmiş bölgenin pozitif kutup konumunu değiştirerek basitçe seçilebilir. Sık sık, merkezi sinir sisteminin pek çok bölge ta olabilir gösterilmiştir^3,5-8 rgeted. Örneğin, son çalışmalar hipokampus, striatum piriform kortekste veya ^9-11 belirli transfections göstermektedir. Ancak, uygun pozisyonlar hakkında bilgiler genellikle sadece nadiren standardize ve her zaman farklı fare suşları aktarmak kolay değildir.

Bazı embriyonik evrelerinin Transfeksiyon önemsiz olmaktan uzaktır. Utero elektroporasyon spesifik için set-up seçerken Birçok etkileyen faktörler dikkate alınmalıdır. İlk olarak, optimum ilgili embriyonik aşamalarında transfect uygun gerilimlerinin hakkında bilgiye ihtiyaç vardır. Düşük gerilimler transfeksiyon verimi ^2,3,12 azaltmak ise yüksek gerilim, hayatta kalma oranını düşürmek. Ayrıca elektrot raket boyutu, önemli bir rol oynar düşürülmüş özgüllük çok büyük sonuçlar ya bağlı kalp ritmi ^4,12,13 ve sevgi ile ölüme neden olabilir elektrot kürekler kullanımı nedeniyle. Uygulanangerilim ve boyut ve elektrot kürek konumu dikkat edilmesi gereken en önemli özelliklerdir, ancak DNA çözümün uygulanan miktarı gibi, elektroporasyon sonucu etkileyen başka faktörler de vardır.

Biz C57BL / 6 fare ¹² farklı beyin bölgelerinin hızlı ve etkin transfeksiyon sağlayan ayrıntılı bir protokol geliştirdik. Bu protokolde gerilimlerde hakkında ayrıntılı bilgiler kullanılmak üzere geliştirilmiş ve özgünlük için elektrot raket boyutu sağlanır. Bundan başka, ventrikül ilgili bilgiler plazmid solüsyonu miktarı ve elektrodun pozisyonu için öneriler sağlanır birlikte doldurulacak. Bir harita ve bu pozisyonlarda daha görselleştirme ayrıntılı konum bilgisi göstergesi retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, t utero elektroporasyon basit özgü ve verimli sağlarO ammonis 1-3, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek, talamus ve hipotalamus Cornu.

Protokol

Etik Beyanı: Farelerde ve deneysel prosedürlerin işleme hayvan bakımı için, Avrupa, ulusal ve kurumsal kurallara uygun olarak yapılmıştır.

1. Giriş Utero Elektroporasyon

Not: Daha önce ^12,14 yayınlanan utero elektroporasyon gerçekleştirildi. Bu nedenle, yöntem aşağıdaki (Şekil 1) kısaca tarif okunur.

1. Hazırlıklar
   1. Daha önce açıklandığı gibi ¹² (1,5 pCAGGS içeren) Hızlı Yeşil renkli endotoksin içermeyen gelişmiş transfeksiyon dereceli plazmid çözüm hazırlayın.
   2. Enjeksiyonlar için (35 ° açı) borosilikat cam kılcal (0,8-0,9 çap) çekin ve eziyet.
   3. Aletleri sterilize edin.
2. Cerrahlık
   1. Ameliyat öncesi analjezikler (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, sc, 24 saat depo) en az 30 dakika uygulayın.
   2. Uzunluğunu tutun(- cerrahi anestezi aşaması guedel ^{15'e göre} - Evre III maksimal 25-30 dakika) 35-45 dakika arasında en fazla anestezi.
   3. (: Maske ile% 2.8, ameliyat:% 2.5 indüksiyon bir odasında) izofluran ile zamanlanmış hamile fareler anestezi. Ayak tutam yanıtsızlık ile anestezi onaylayın.
   4. Anestezi sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
   5. % 7.5 providon-İyot çözeltisi ile cerrahi alan sterilize ve maruz sadece cerrahi alana sahip (% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ile nemli) steril gazlı bez ile fare kaplayın.
   6. (: 1.5-2 cm, kas kesi: 1-1.5 cm cilt kesisi) bir neşter ile karın boşluğuna açın kesin.
   7. Veteriner personel veya komite tarafından yönlendirilen ısındı% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ya da diğer steril izotonik solüsyon ile nemlendirerek kurumasını açılan karın boşluğuna koruyun.
   8. Dikkatle parmağınızla rahim dokunmayın, halka forseps kullanarak rahim boynuzları (ayıklamaks).
3. DNA ve elektroporasyon enjeksiyonu. Not: Belirli bölgeleri hedefleyen için kesin ayrıntılar 2. bölümünde belirtilmiştir.
   1. Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla Şekil 1 ve 2. bölümünde belirtildiği gibi yavaşça ventrikül içine renkli DNA çözüm enjekte edilir.
   2. İlgili embriyonik aşama için uygun gerilim uygulayın (örn. E14 için, 36-38 V) özel forseps tipi platin elektrot (aralık döngüsü uzunluğu 50 ms, aralık duraklama 950 msn) aracılığıyla. Rahim duvarının hasarı en aza indirmek için voltajın uygulanması sırasında elektroporasyon kürekler Pulse.
4. Mesaj elektroporasyon / post-operatif bakım
   1. Dikkatle karın boşluğunda rahim boynuzları değiştirin.
   2. Kas ve ayrı ayrı cilt kesisi dikin.
   3. Kurtarma için bir termal destek cihazı fare dinlendirin.
   4. Kurtarma sırasında fare (davranış, yem denetlemek veSu tüketimi), 4 saat, 24 saat ve 48 saat sonra ameliyat. Gerekirse, 2 gün daha fazla analjezik (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, 24 saat depo) uygulanır.

Belirli Serebral Alanlarının 2. Transfeksiyon

Not: pozitif kutup pozisyonu DNA ana madde çözeltisi (sağ ya da üçüncü ventrikül) ve pozitif kutup konumu ile dolu ventrikül ile dikey merkez çizgisi arasındaki açı olarak gösterilir. Sol ventrikül doldururken pozisyonları ayna ters bulunmaktadır. Şekil 4'te kulak Primordial pozisyonları önemli referans noktaları sağlayan gösterilir.

1. Kortikal alanlara transfeksiyonu (Şekil 2A, Tablo 1).
   1. Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Kortikal alanların in utero elektroporasyon için E14 embriyolar kullanın.
   2. Sağ lateral ventrikül 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1.5-2 enjekteHazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden.
      1. Dikkatle Ponksiyon üzerinde hiçbir görünür gemiler vardır, böylece halka forseps kullanarak embriyo yerleştirin.
      2. Yavaş yavaş lambdoidal sütür yaklaşık 0.75 mm koronal ve sagital sütür (Şekil 3) 0,5 mm lateral DNA çözüm enjekte. Ekleme derinliği 1,2 mm (rahim duvarından ölçülen E14) olduğundan emin olun. Keskin bir sınır ile bir mavi-yeşil renk olup olmadığını kontrol edin.
   3. Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
      1. 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın.
      2. 36-38 V arasında değişen bir gerilim kullanın
      3. Elektrotların kulak primordia sadece ön merkezini yerleştirin.
      4. , Motor korteks 0-40 ° transfect transfect, somatosensoriyel korteks 40-95 ° transfect, 330-0 ° den retrosplenial korteks kullanım açıları transfectpiriform korteks 95-110 ° (Şekil 2A).
   4. Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 4 gün analiz eder.
2. Hipokamp (Şekil 2B, Tablo 1) transfeksiyonu.
   1. Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Hipokampal formasyonun utero elektroporasyon için E15 embriyoların kullanın.
   2. Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 2 enjekte edilir.
   3. Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
      1. 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın.
      2. 38-40 arasında değişen bir gerilim kullanın.
      3. Negatif kutup kulak primordiumunun sadece ön merkezi ve merkezi o koyunKulak primordiumunun ortasında pozitif kutup f.
      4. Dentat girus CA1 250-275 ° (Şekil 2B) transfekte etmek üzere, Ca + 2 230-250 ° transfekte etmek, cornu ammonis (CA) 3 210-230 ° transfekte etmek, 190-210 ° 'den açılarıyla transfekte etmek.
   4. Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. 3. bölümde açıklandığı gibi (doğum, p21 sonra) tamamlandıktan hipokampal oluşumundan sonra analiz gerçekleştirin.
3. Lateral septal çekirdeği ve striatum transfeksiyonu (Şekil 2C, Tablo 1)
   Not: açıları hipokampus transfecting için olanlar ile örtüşüyor. Etkin bir yanal septal çekirdeğe ve istenmeyen hipokampus transfeksiyon erken embriyonik aşamalarda (E12) olmadan striatum transfect için kullanılmalıdır.
   1. Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Lateral septal çekirdek ve striat in utero elektroporasyon içinum E12 embriyoları kullanılır.
   2. Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1 enjekte edilir.
   3. Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
      1. 0.5 mm'lik bir elektrot kullanın.
      2. 33 V kullanın
      3. Kulak primordia düzeyinde elektrotların merkezini yerleştirin.
      4. Striatum 170-240 ° (Şekil 2C) transfekte edilmesi için, 100-170 ° yanal septal çekirdeği kullanımı açıları transfekte etmek.
   4. Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder.
4. Talamus ve hipotalamus Transfeksiyonu (Şekil 2B, Tablo 1)
   1. Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. U içintalamus ve hipotalamus kullanımı E12-E13 embriyoların tero elektroporasyon.
   2. Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla lateral ventrikül (sağ veya sol) 4 ug DNA içeren 1-1.5 ul DNA çözümü enjekte edilir. Çözüm, üçüncü ventrikül içine yayılır kadar, 2-3 dakika bekleyin. Alternatif doğrudan üçüncü ventrikül içine enjekte edilir.
      Not: Bu özgüllüğünü arttırır fakat azalmış sağkalım oranı (hasar riski yüksek) neden olabilir.
   3. Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
      1. 0.5 veya 3 mm elektrot kullanın.
      2. 33-35 V arasında değişen bir gerilim kullanın
      3. Kulaktan Primordia posterior elektrot merkezi yerleştirin.
      4. Hipotalamus 90-180 ° (Şekil 2D) transfect, 25-40 ° ile talamus kullanım açıları transfect.
   4. Des gibi post elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirinbölüm 1.4 açıklanan şekilde. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder.

3. Perfüzyon Fixation

1. Hazırlıklar
   1. Sıcak% 4 paraformaldehid (PFA) 37 ° C arasındadır.
   2. PBS ile 50 ml şırınga (4 ° C) ve ısıtılmış PFA ile ikinci bir şırınga doldurun. Kabarcıkları kaçının.
   3. Üç yollu için şırınga bağlayın. Kanatlı infüzyon seti (kelebek) üçüncü ucunu.
   4. PBS ile kanatlı infüzyon seti yıkayın.
2. Serpilme
   1. Derin subkutan ketamin hidroklorür uygulama (60 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) ile (gebe veya doğum sonrası transfekte edilmiş) fareler anestetize.
   2. Ayak tutam yanıtsızlık cerrahi tolerans sahne onaylayın.
   3. Sadece göğüs kafesine altında karın boşluğuna açın.
   4. Dikkatle diyaframı kesti.
   5. Dikkatle e bir kesim üzerinden göğüs kafesini açmakköprücük kemiği kadar ach sitesi.
   6. (Kalbin apeks başlayarak) sol kalp odasına kelebeğin ucu takın.
   7. Sol atriyal apendiks kesin.
   8. Yavaş yavaş PBS (yaklaşık 10 mi) ile fare serpmek.
   9. Üç yönlü stopcock geçin.
   10. 5-10 ml% 4 PFA ile fareyi serpmek.
   11. Makas kullanılarak fare başını kesmek ve foramen magnum başlayan beyin teşrih. Daha önce ¹⁶ yayınlanan diseksiyon.
   12. % 4 PFA 2 gün beyin Postfixate. Karanlıkta 4 ° C'de tutun beyinleri.

4. İmmünhistokimya

1. (Bir vibratome ile örneğin) 70 mikron bölümleri oluşturun.
2. İsteğe bağlı: antikor boyama ile floresan geliştirin.
   1. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke bölümleri (% 0.1-0.2 Triton X-100,% 5 normal keçi serumu)
   2. Uygun bir antikor (: 1000 anti-GFP, 1) ile O / N inkübe
   3. Yıkama 30.1 M fosfat tamponu ile -5 kez.
   4. Uygun floresan-konjuge sekonder antikor (: 1000 Alexa Fluor 488 konjuge edilmiş anti-tavşan IgG, 1), 3-5 saat inkübe edin.
   5. İsteğe bağlı: 1 dakika süre ile (0,1 M fosfat tampon maddesi içinde DAPI, 0.2 ug / ml), 4-6-diaminodino-2-fenilindol ile Counterstain.
   6. Uygun bir floresan mikroskop ile floresan analiz.

Sonuçlar

Şekil 2, retrosplenial korteks içine gelişen bölgelerin utero elektroporasyon belirli için örnekler gösterir, motor korteks, somatosensorial korteks, piriform korteks, cornu 1-3 ammonis, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek , talamus ve hipotalamus. Transfeksiyonlarının sonuçları tavsiye açı (Şekil 2) yanında gösterilmiştir. In vivo açıları daha iyi görüntülenmesi için elektrot (0,5 mm) konumu da (amniotik kese içinde Şekil 5&#...

Tartışmalar

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV