Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

Resumen

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Resumen

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introducción

Desde la primera descripción en 2001 por tres grupos independientes ^1-3 i n electroporación utero se ha convertido en una herramienta estándar ampliamente utilizado para el análisis de la expresión génica en el sistema nervioso central de roedores. En comparación con la generación de ratones knock-out, que es, a pesar de la mejora continua de las técnicas, aún de tiempo y dinero que consumen, las apelaciones en el útero de electroporación debido a su simplicidad. Así, en el útero de la electroporación permite ganancia-rápido y eficiente y la pérdida de la función de los estudios ^4.

Para transfectar las regiones cerebrales, la solución que contiene el plásmido cargado negativamente se inyecta en un ventrículo. Durante el pulso eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el polo positivo y por lo tanto la región transfectadas se puede seleccionar simplemente alterando la posición del polo positivo. Con frecuencia se ha demostrado que numerosas regiones del sistema nervioso central pueden ser targeted ^3,5-8. Por ejemplo, estudios recientes muestran transfecciones específicas del hipocampo, la corteza piriforme o el cuerpo estriado ^{9 a 11.} Sin embargo, la información sobre las posiciones adecuadas son a menudo sólo apenas estandarizada y no son siempre fáciles de transferir a diferentes cepas de ratón.

La transfección de ciertas etapas embrionarias está lejos de ser trivial. Son muchos los factores que influyen deben tenerse en cuenta al elegir la puesta a punto para la electroporación específico en el útero. En primer lugar, para transfectar de manera óptima las respectivas etapas embrionarias, se necesita conocimiento sobre los voltajes apropiados. Altas tensiones disminuyen la tasa de supervivencia, mientras que bajas tensiones reducen el ^2,3,12 eficacia de transfección. También el tamaño de la paleta electrodo desempeña un papel crucial, porque el uso de paletas de electrodos que son demasiado grandes resultados en la especificidad reducida o pueden causar la muerte debido a la afección del ritmo cardíaco ^4,12,13. El aplicadatensión y el tamaño y la posición de la pala de electrodo son las características más importantes a considerar, pero también hay otros factores que influyen en el resultado de la electroporación, al igual que la cantidad aplicada de ADN-solución.

Hemos desarrollado un protocolo detallado que permite la transfección rápida y eficaz de diversas regiones cerebrales del ratón C57BL / 6 ^12. En este protocolo de información detallada acerca de las tensiones que se utilizará y se proporciona el tamaño de la paleta de electrodos para la especificidad mejorada. Además, la información sobre el ventrículo para ser llenado junto con recomendaciones para la cantidad de solución de plásmido y la posición del electrodo se suministra. La indicación de la información de posición en un mapa detallado y adicionalmente a la visualización de estas posiciones permite específica sencilla y eficiente en el útero de la electroporación de la corteza retroesplenial, la corteza motora, la corteza somatosensorial, la corteza piriforme t,él Cornu ammonis 1-3 el giro dentado, el cuerpo estriado, el núcleo septal lateral, el tálamo y el hipotálamo.

Protocolo

Declaración de Ética: El manejo de los ratones y los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las directrices europeas, nacionales e institucionales para el cuidado de animales.

1. In Utero electroporación

Nota: En electroporación in utero se realizó según lo publicado previamente ^12,14. Por lo tanto, el método sólo se describe brevemente a continuación (Figura 1).

1. Preparativos
   1. Prepare la solución Fast Green color libre de endotoxinas avanzada plásmido transfección de grado (que contiene 1,5 pCAGGS) como se ha descrito previamente ^12.
   2. Tire y moler (35 ° ángulo) capilares de vidrio de borosilicato (0,8 hasta 0,9 de diámetro) para inyecciones.
   3. Esterilizar los instrumentos.
2. Cirugía
   1. Administrar analgésicos (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, SC, 24 hr depot) al menos 30 min antes de iniciar la cirugía.
   2. Mantenga la longitud dela anestesia a un máximo de de 35-45 min (Etapa III - etapa de anestesia quirúrgica de acuerdo con Guedel ¹⁵ - máxima de 25-30 min).
   3. Anestesiar ratones temporizados embarazadas con isoflurano (inducción en una cámara: 2,8%, la cirugía a través de la máscara: 2,5%). Confirme la anestesia por la falta de respuesta a los pies de pellizcar.
   4. Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad ocular durante la anestesia.
   5. Esterilizar el área quirúrgica con solución providona-yodo 7,5% y cubrir el ratón con una gasa estéril (húmeda con solución salina al 0,9% de alcohol bencílico) con sólo el área quirúrgica expuesta.
   6. Cortar abrir la cavidad abdominal con un bisturí (incisión de la piel: 1.5-2 cm, la incisión del músculo: 1-1.5 cm).
   7. Preservar la cavidad abdominal abierta se sequen humedeciendo con calentado solución salina alcohol bencílico 0,9% u otra solución isotónica estéril como lo indique el personal veterinario o comité.
   8. Extraer con cuidado cuernos uterinos (utilizando unas pinzas de anillo, no toque el útero con el dedos).
3. La inyección de DNA y electroporación. Nota: Los detalles exactos de focalización regiones específicas se indican en el apartado 2.
   1. Lentamente inyectar la solución de ADN de color en el ventrículo como se indica en la Figura 1 y la sección 2 a través de los capilares de borosilicato preparadas.
   2. Aplicar la tensión adecuada para la etapa embrionaria correspondiente (por ejemplo., 36 a 38 V para E14) a través de electrodos especializados de tipo fórceps platino (ciclo de intervalo de longitud de 50 ms, el intervalo de pausa de 950 ms). Pulso de electroporación las paletas durante la aplicación de la tensión para minimizar el daño de la pared uterina.
4. Publicar electroporación / cuidado postoperatorio
   1. Vuelva a colocar cuidadosamente los cuernos uterinos en la cavidad abdominal.
   2. Suturar el músculo y la incisión de la piel por separado.
   3. Que el resto del ratón en un dispositivo de soporte térmico para la recuperación.
   4. Supervisar el ratón durante la recuperación (comportamiento, alimentación yel consumo de agua), 4 horas, 24 horas y 48 horas después de la cirugía. Si es necesario, aplicar analgésicos adicionales (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, 24 horas de depósito) para otros 2 días.

2. La transfección de áreas cerebrales específicas

Nota: La posición del polo positivo se muestra como el ángulo entre la línea central vertical a través del ventrículo lleno de la solución de ADN (el ventrículo derecho o tercero) y la posición del polo positivo. Al llenar el ventrículo izquierdo las posiciones son espejo invertido. En la Figura 4 se muestran las posiciones de la oreja primordial, que proporcionan puntos de referencia importantes.

1. La transfección de las áreas corticales (Figura 2A, Tabla 1).
   1. Realizar la cirugía tal como se describe en la sección 1.2. Para la electroporación en el útero de las áreas corticales utilizar embriones E14.
   2. Inyectar 1,5 a 2 l de ADN solución que contiene ADN 4 mg en el ventrículo lateral derechoa través de los capilares de borosilicato preparadas.
      1. Posicionar cuidadosamente el embrión mediante el uso de pinzas de anillo de manera que no hay vasos visibles por encima del sitio de la punción.
      2. Lentamente inyectar el ADN de aproximadamente 0,75 mm solución coronal de la sutura lambdoidea y 0,5 mm lateral desde la sutura sagital (Figura 3). Asegúrese de que la profundidad de inserción es 1,2 mm (E14, medida desde la pared uterina). Compruebe si hay una coloración azul-verde con una demarcación nítida.
   3. Aplicar tensión a través de los electrodos de platino especializados de tipo fórceps (ciclo de intervalo de longitud de 50 ms, el intervalo de pausa de 950 ms).
      1. Utilice una paleta electrodo de 3 o 5 mm.
      2. Utilice un voltaje que varía desde 36 hasta 38 V.
      3. Coloque el centro de los electrodos justo anterior de los primordios del oído.
      4. Para transfectar los ángulos uso corteza retrosplenial 330-0 °, para transfectar la corteza motora 0-40 °, para transfectar la corteza somatosensorial 40-95 °, para transfectarla corteza piriforme de 95-110 ° (Figura 2A).
   4. Realizar electroporación / cuidado post-operatorio después como se describe en la sección 1.4. Sacrificar los ratones y analizar los embriones 4 días después de la electroporación (E18) como se describe en la sección 3.
2. La transfección del hipocampo (Figura 2B, Tabla 1).
   1. Realizar la cirugía tal como se describe en la sección 1.2. Para la electroporación en el útero de la formación del hipocampo utilizar embriones E15.
   2. Inyectar 2 l de ADN solución que contiene 4 g de ADN en el ventrículo lateral derecho a través de los capilares de borosilicato preparadas.
   3. Aplicar tensión a través de los electrodos de platino especializados de tipo fórceps (ciclo de intervalo de longitud de 50 ms, el intervalo de pausa de 950 ms).
      1. Utilice una paleta electrodo de 3 o 5 mm.
      2. Utilice un voltaje que varía desde 38 hasta 40.
      3. Coloque el centro del polo negativo justo anterior del primordio oreja y el centro Of el polo positivo en el medio de la primordio oído.
      4. Para transfectar el giro dentado utilizan ángulos 190-210 °, para transfectar la ammonis Cornu (CA) 3 210-230 °, para transfectar la CA2 230-250 °, para transfectar la CA1 250-275 ° (Figura 2B).
   4. Realizar electroporación / cuidado post-operatorio después como se describe en la sección 1.4. Realizar análisis después de la formación del hipocampo completa (después del nacimiento, p21) como se describe en la sección 3.
3. La transfección del núcleo septal lateral y el cuerpo estriado (Figura 2C, Tabla 1)
   Nota: Los ángulos se superponen con los para transfectar el hipocampo. Para transfectar eficazmente el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado y sin transfección hipocampo no deseado primeras etapas embrionarias (E12) tienen que ser utilizados.
   1. Realizar la cirugía tal como se describe en la sección 1.2. Para la electroporación en el útero del núcleo septal lateral y striatum utilizar embriones E12.
   2. Inyectar 1 l de ADN solución que contiene 4 g de ADN en el ventrículo lateral derecho a través de los capilares de borosilicato preparadas.
   3. Aplicar tensión a través de los electrodos de platino especializados de tipo fórceps (ciclo de intervalo de longitud de 50 ms, el intervalo de pausa de 950 ms).
      1. Utilice un electrodo de 0,5 mm.
      2. Utilice 33 V.
      3. Coloque el centro de los electrodos a nivel de los primordios del oído.
      4. Para transfectar los ángulos uso núcleo septal lateral 100-170 °, para transfectar el cuerpo estriado 170 a 240 ° (Figura 2C).
   4. Realizar electroporación / cuidado post-operatorio después como se describe en la sección 1.4. Sacrificar los ratones y analizar los embriones de 6 días después de la electroporación (E18) como se describe en la sección 3.
4. La transfección del tálamo y el hipotálamo (Figura 2D, la Tabla 1)
   1. Realizar la cirugía tal como se describe en la sección 1.2. Para el en utero electroporación de los tálamo y el hipotálamo uso embriones E12-E13.
   2. Inyectar 1-1.5-solución de ADN que contiene 4 l g de ADN en el ventrículo lateral (izquierda o derecha) a través de los capilares de borosilicato preparadas. Esperar durante 2-3 min, hasta que la solución se difunde en el tercer ventrículo. Alternativamente inyectar directamente en el tercer ventrículo.
      Nota: Esto mejora la especificidad, pero podría causar una disminución de la tasa de supervivencia (alto riesgo de daño).
   3. Aplicar tensión a través de los electrodos de platino especializados de tipo fórceps (ciclo de intervalo de longitud de 50 ms, el intervalo de pausa de 950 ms).
      1. Utilice un electrodo de 0,5 o 3 mm.
      2. Utilice un voltaje que varía desde 33 hasta 35 V.
      3. Coloque el centro de los electrodos justo por detrás de los primordios de oído.
      4. Para transfectar los ángulos uso tálamo 25-40 °, para transfectar el hipotálamo 90-180 ° (Figura 2D).
   4. Realizar posterior electroporación / cuidado post-operatorio como described en la sección 1.4. Sacrificar los ratones y analizar los embriones de 6 días después de la electroporación (E18) como se describe en la sección 3.

3. Perfusión Fijación

1. Preparativos
   1. Cálido 4% de paraformaldehído (PFA) a 37 ° C.
   2. Llene una jeringa 50 ml con PBS (4 ° C) y una segunda jeringa con calentado PFA. Evite las burbujas.
   3. Conecte las jeringas a una llave de tres vías. Conecte el tercer extremo a un equipo de infusión alado (mariposa).
   4. Lave el equipo de infusión alado con PBS.
2. Perfusión
   1. Profundamente anestesiar a los ratones (embarazada o postnatal transfectadas) con la aplicación subcutánea de hidrocloruro de ketamina (60 mg / kg) y xilazina (7,5 mg / kg).
   2. Confirme la etapa de tolerancia quirúrgica por la falta de respuesta a los pies de pellizcar.
   3. Abra la cavidad abdominal justo debajo de la caja torácica.
   4. Corte cuidadosamente el diafragma.
   5. Abra cuidadosamente la caja torácica a través de un corte en el correositio ada hasta la clavícula.
   6. Inserte la punta de la mariposa en la cámara del corazón izquierdo (empezando desde el vértice del corazón).
   7. Cortar la orejuela de la aurícula izquierda.
   8. Lentamente perfundir el ratón con PBS (aproximadamente 10 ml).
   9. Cambie la llave de tres vías.
   10. Perfundir el ratón con 5 a 10 ml de PFA al 4%.
   11. Decapitar al ratón usando tijeras y diseccionar el cerebro que comienza en el agujero occipital. Realizar la disección según lo publicado previamente ^16.
   12. Postfixate el cerebro durante 2 días en 4% PFA. Mantener los cerebros a 4 ° C en la oscuridad.

4. La inmunohistoquímica

1. Generar 70 micras secciones (por ejemplo, con un vibratome).
2. Opcional: Mejorar la fluorescencia con la tinción de anticuerpos.
   1. Bloquear las secciones durante 1 hora a RT (0,1 a 0,2% de Triton X-100, 5% de suero normal de cabra)
   2. Incubar O / N con el anticuerpo apropiado (anti-GFP, 1: 1000)
   3. Lavar 3-5 Veces con tampón de 0,1 M fosfato.
   4. Incubar 3-5 h con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia apropiado (Alexa Fluor 488 conjugado anti-IgG de conejo, 1: 1000).
   5. Opcional: contratinción con 4-6-diaminodino-2-fenilindol (DAPI, 0,2 g / ml en tampón fosfato 0,1 M) durante 1 min.
   6. Analizar la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia adecuado.

Resultados

La figura 2, muestra ejemplos de lo específico en el útero de la electroporación de las regiones en desarrollo en la corteza retroesplenial, la corteza motora, la corteza somatosensorial, la corteza piriforme, el cornu Ammonis 3.1, el giro dentado, el cuerpo estriado, el núcleo septal lateral , el tálamo y el hipotálamo. Los resultados de las transfecciones se muestran al lado del ángulo recomendado (Figura 2). Para una mejor visualización de los ángulos en

Discusión

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV