Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

Résumé

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Résumé

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

Depuis la première description en 2001 par trois groupes indépendants ^1-3 i n utero électroporation est devenu un outil standard largement utilisé pour l'analyse de l'expression des gènes dans le système nerveux central des rongeurs. Par rapport à la génération de souris knock-out, ce qui est, en dépit de l'amélioration continue des techniques, encore temps et d'argent, de consommer les électroporation in utero appels en raison de sa simplicité. Donc, in utero électroporation permet intensité forte rapide et efficace et des études de perte de fonction ^4.

Pour transfecter les régions cérébrales, la solution contenant le plasmide chargé négativement est injecté dans un ventricule. Pendant l'impulsion électrique, l'ADN chargé négativement migre vers le pôle positif et, par conséquent la région transfectée peut être sélectionnée simplement en modifiant la position du pôle positif. Il a été démontré fréquemment que de nombreuses régions du système nerveux central peuvent être targeted ^3,5-8. Par exemple, des études récentes montrent transfections spécifiques de l'hippocampe, le cortex piriforme ou le striatum ^11/09. Cependant, les informations sur les positions appropriées ne sont souvent guère normalisée et ne sont pas toujours faciles à transférer à différentes souches de souris.

Transfection de certaines étapes embryonnaires est loin d'être anodin. De nombreux facteurs influencent doivent être prises en considération lors du choix du set-up pour spécifique électroporation in utero. Tout d'abord, pour la transfection de manière optimale les stades embryonnaires respectifs, les connaissances sur les tensions appropriées est nécessaire. Des tensions élevées diminuent le taux de survie, alors que de faibles tensions réduisent la ^2,3,12 de l'efficacité de transfection. Également la taille de la palette de l'électrode joue un rôle crucial, car l'utilisation de palettes d'électrodes qui sont trop grands résultats dans la spécificité réduite ou peuvent causer la mort en raison de l'affection du rythme cardiaque ^4,12,13. La appliquéla tension et la taille et la position de la palette d'électrode sont les caractéristiques les plus importantes à considérer, mais il ya aussi d'autres facteurs qui influent sur le résultat de l'électroporation, comme la quantité appliquée de l'ADN-solution.

Nous avons développé un protocole détaillé qui permet transfection rapide et efficace des diverses régions cérébrales de la souris C57BL / 6 ^12. Dans ce protocole, des informations détaillées sur les tensions à être utilisé et la taille de la palette d'électrode pour une spécificité accrue est fourni. En outre, des informations sur le ventricule à être rempli avec des recommandations pour la quantité de solution de plasmide et la position de l'électrode est fournie. L'indication de l'information de position dans un plan détaillé et la poursuite de la visualisation de ces positions permet spécifique simple et efficace de l'électroporation in utero du cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, til corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral, le thalamus et l'hypothalamus.

Protocole

Déclaration d'éthique: La manipulation de la souris et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives européennes, nationales et institutionnelles pour les soins aux animaux.

1. électroporation in utero

Remarque: In utero électroporation a été réalisée comme précédemment publiée ^12,14. Par conséquent, le procédé est seulement brièvement décrit ci-après (figure 1).

1. Les préparatifs
   1. Préparer couleur verte solution (contenant 1,5 pCAGGS) rapide sans endotoxine avancée transfection plasmidique-grade comme décrit précédemment ^12.
   2. Tirez et broyer (35 ° d'angle) capillaires en verre borosilicate (0,8-0,9 de diamètre) pour les injections.
   3. Stériliser les instruments.
2. Chirurgie
   1. Administrer des analgésiques (carprofène, 4 mg / kg de poids corporel, SC, dépôt de 24 h) au moins 30 min avant de commencer la chirurgie.
   2. Gardez la longueur del'anesthésie à un maximum de 35-45 min (Phase III - stade de l'anesthésie chirurgicale en fonction de Guedel ¹⁵ - maximale 25-30 min).
   3. Anesthésier les souris enceintes chronométrés avec l'isoflurane (induction dans une chambre: 2,8%, la chirurgie par masque: 2,5%). Confirmez l'anesthésie par l'absence de réponse à l'orteil-pincement.
   4. Appliquer une pommade oculaire pour éviter la sécheresse oculaire pendant l'anesthésie.
   5. Stériliser la zone chirurgicale avec 7,5% de solution Providone-iode et couvrir la souris avec de la gaze stérile (humide avec une solution à 0,9% d'alcool benzylique saline) avec seulement la zone chirurgicale exposée.
   6. Couper ouvrir la cavité abdominale avec un scalpel (incision de la peau: 1,5-2 cm, incision musculaire: 1-1,5 cm).
   7. Préserver la cavité abdominale ouverte de sécher en les humectant avec réchauffé solution alcool benzylique saline à 0,9% ou toute autre solution isotonique stérile comme dirigé par le personnel vétérinaire ou un comité.
   8. Extraire soigneusement cornes utérines (en utilisant une pince à anneau, ne touchez pas l'utérus avec le doigts).
3. L'injection d'ADN et d'électroporation. Remarque: Les détails exacts pour cibler des régions spécifiques sont indiqués à l'article 2.
   1. Injecter lentement la solution d'ADN coloré dans le ventricule, comme indiqué sur la figure 1 et la section 2 par l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées.
   2. Appliquer la tension appropriée pour le stade embryonnaire correspondant (par exemple., 36-38 V pour E14) par l'intermédiaire d'électrodes spécialisées pince de type platine (cycle de 50 ms d'intervalle longueur, intervalle de pause 950 ms). Les palettes d'impulsion d'électroporation pendant l'application de la tension pour minimiser les dommages de la paroi utérine.
4. Poster électroporation / soins post-opératoires
   1. Remettre soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale.
   2. Suturer le muscle et l'incision de la peau séparément.
   3. Laisser reposer la souris sur un dispositif de soutien pour la récupération thermique.
   4. Superviser la souris lors de la récupération (comportement, fourrage etla consommation d'eau), 4 h, 24 h et 48 h après l'opération. Si nécessaire, appliquer analgésiques supplémentaires (carprofène, 4 mg / kg de poids corporel, un dépôt de 24 h) pour plus de 2 jours.

2. La transfection des zones cérébrales spécifiques

Remarque: La position du pôle positif est représenté comme étant l'angle entre la ligne centrale verticale passant par le ventricule rempli avec la solution d'ADN (le ventricule droit ou troisième) et la position du pôle positif. Lors du remplissage du ventricule gauche les positions sont miroir inversé. Sur la figure 4, les positions de la primordial de l'oreille sont représentés, qui fournissent des points de référence importants.

1. Transfection des aires corticales (figure 2A, Tableau 1).
   1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero de zones corticales utiliser des embryons E14.
   2. Injecter 1,5-2 ul ADN solution contenant de l'ADN de 4 pg dans le ventricule latéral droitpar l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées.
      1. Positionner soigneusement l'embryon en utilisant une pince à anneau afin qu'il n'y ait pas de vaisseaux visibles au-dessus du site de ponction.
      2. Injecter lentement la solution d'ADN d'environ 0,75 mm à partir de la suture coronale lambdoïde et 0,5 mm latéral de la suture sagittale (figure 3). Assurez-vous que la profondeur d'insertion est de 1,2 mm (E14, mesurée à partir de la paroi utérine). Vérifiez une coloration bleu-vert avec une démarcation nette.
   3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode paddle 3 ou 5 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 36 à 38 V.
      3. Placez le centre des électrodes juste antérieures des ébauches oreille.
      4. Pour transfecter les angles rétrosplénial d'utilisation du cortex ° 330-0, pour transfecter le cortex moteur 0-40 ° par rapport à transfecter le cortex somatosensoriel 40 à 95 ° par rapport à transfecterle cortex piriforme de 95 à 110 ° (figure 2A).
   4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 4 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.
2. La transfection de l'hippocampe (figure 2B, tableau 1).
   1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero de formation hippocampique utiliser des embryons E15.
   2. Injecter 2 ul ADN solution contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral droit via les capillaires de borosilicate préparées.
   3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode paddle 3 ou 5 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 38 à 40.
      3. Placer le centre du pôle négatif juste antérieure de l'ébauche de l'oreille et du centre of le pôle positif au milieu de l'ébauche de l'oreille.
      4. Pour transfecter le gyrus denté utilisent des angles de 190 à 210 °, afin de transfecter la corne d'Ammon (CA) 3 210-230 °, pour transfecter l'CA2 230 à 250 °, afin de transfecter la CA1 250-275 ° (figure 2B).
   4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Effectuer une analyse complète après formation hippocampique (après la naissance, p21), comme décrit dans la section 3.
3. La transfection du noyau septal latéral et le striatum (figure 2C, Tableau 1)
   Remarque: Les angles se chevauchent avec ceux pour la transfection de l'hippocampe. Pour transfecter efficacement le noyau septal latéral et l'hippocampe striatum sans indésirable transfection stades embryonnaires (E12 précédemment) doivent être utilisés.
   1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero du noyau septal latéral et striatum utiliser des embryons E12.
   2. Injecter 1 ul ADN solution contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral droit via les capillaires de borosilicate préparées.
   3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode de 0,5 mm.
      2. Utilisez 33 V.
      3. Placez le centre des électrodes au niveau des primordia de l'oreille.
      4. Pour transfecter les angles latéraux utilisation septale noyau 100-170 °, pour transfecter le striatum de 170 à 240 ° (figure 2C).
   4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 6 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.
4. La transfection du thalamus et de l'hypothalamus (figure 2D, tableau 1)
   1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'en uTero électroporation des thalamus et l'hypothalamus utiliser des embryons E12-E13.
   2. Injecter de 1 à 1,5 solution d'ADN-pi contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral (gauche ou droite) par l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées. Attendez 2-3 min, jusqu'à ce que la solution est diffusée dans le troisième ventricule. Alternativement injecter directement dans le troisième ventricule.
      Note: Ceci augmente la spécificité, mais pourrait provoquer un taux de survie diminué (risque élevé de dommages).
   3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode de 0,5 ou 3 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 33 à 35 V.
      3. Placez le centre des électrodes juste derrière les ébauches oreille.
      4. Pour transfecter les angles d'utilisation de 25 à 40 ° thalamus, l'hypothalamus pour transfecter 90-180 ° (figure 2D).
   4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme described dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 6 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.

3. Fixation Perfusion

1. Les préparatifs
   1. Chaud paraformaldéhyde 4% (PFA) à 37 ° C.
   2. Remplir une seringue de 50 ml avec du PBS (4 ° C) et une seconde seringue avec réchauffé PFA. Éviter les bulles.
   3. Connecter les seringues à un robinet à trois voies. Branchez la troisième fin à un ensemble de perfusion à ailes (papillon).
   4. Rincer le dispositif de perfusion à ailes avec du PBS.
2. Perfusion
   1. Profondément anesthésier les souris (enceinte ou postnatale transfectées) avec l'application sous-cutanée de chlorhydrate de kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (7,5 mg / kg).
   2. Confirmez l'étape chirurgicale de la tolérance par l'absence de réponse à l'orteil-pincement.
   3. Ouvrir la cavité abdominale juste au-dessous de la cage thoracique.
   4. Découpez soigneusement le diaphragme.
   5. Soigneusement ouvrir la cage thoracique par une coupure sur esite ACH jusqu'à la clavicule.
   6. Insérez le bout du papillon dans la chambre cardiaque gauche (à partir de la pointe du cœur).
   7. Couper l'appendice auriculaire gauche.
   8. Perfuser lentement la souris avec du PBS (environ 10 ml).
   9. Mettez le robinet à trois voies.
   10. Perfuser la souris avec 5-10 ml 4% PFA.
   11. Décapiter la souris en utilisant des ciseaux et de disséquer le cerveau commence à le foramen magnum. Effectuer la dissection comme précédemment publié ^16.
   12. Postfixate le cerveau pendant 2 jours dans 4% de PFA. Gardez les cerveaux à 4 ° C dans l'obscurité.

4. immunohistochimie

1. Générer 70 sections um (par exemple avec un vibratome).
2. Facultatif: renforcer la fluorescence avec la coloration des anticorps.
   1. Bloquer les sections pour une heure à température ambiante (de 0,1 à 0,2% de Triton X-100, 5% de sérum de chèvre normal)
   2. Incuber O / N avec l'anticorps approprié (anti-GFP, 1: 1000)
   3. Lavez 3-5 Fois avec du tampon phosphate 0,1 M.
   4. Incuber 3-5 h avec l'anticorps secondaire conjugué à de fluorescence approprié (Alexa Fluor 488 conjugué anti-IgG de lapin, 1: 1000).
   5. Facultatif: contre-coloration avec 4-6 diaminodino-phénylindole-2-(DAPI, 0,2 g / ml dans du tampon phosphate 0,1 M) pendant 1 min.
   6. Analyser la fluorescence avec un microscope à fluorescence approprié.

Résultats

Figure 2, montre des exemples pour le spécifique in utero électroporation des régions en développement dans le cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, la corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral , le thalamus et l'hypothalamus. Les résultats des transfections sont présentés à côté de l'angle recommandé (Figure 2). Pour une meilleure visualisation des angles in vivo...

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV