Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

Resumo

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Resumo

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introdução

Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes ^1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos ^4.

Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregado negativamente é injectada num ventrículo. Durante o pulso eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao pólo positivo e, por conseguinte, a região transfectadas podem ser seleccionadas simplesmente alterando a posição do pólo positivo. Tem sido frequentemente demonstrado que várias regiões do sistema nervoso central pode ser TArgeted ^3,5-8. Por exemplo, estudos recentes mostram transfecções específicos do hipocampo, córtex piriforme ou o estriado ^9-11. No entanto, as informações sobre as posições adequadas são muitas vezes apenas mal padronizados e nem sempre são fáceis de transferir para diferentes linhagens de camundongos.

A transfecção de certos estágios embrionários está longe de ser trivial. Muitos fatores influenciam deve ser levado em consideração ao escolher o set-up para específica in utero eletroporação. Em primeiro lugar, para transfectar de forma otimizada as respectivas fases embrionárias, é necessário o conhecimento sobre as tensões apropriadas. Altas tensões diminuir a taxa de sobrevivência, enquanto que baixas voltagens reduzem a eficiência de transfecção ^2,3,12. Também o tamanho da pá eletrodo desempenha um papel crucial, porque o uso de pás de eletrodos que são demasiado grandes resultados em menor especificidade ou podem causar a morte devido ao carinho do ritmo cardíaco ^4,12,13. O aplicadatensão e do tamanho e da posição do eletrodo de remo são as características mais importantes a considerar, mas também há outros fatores que influenciam o resultado da eletroporação, como a quantidade aplicada de solução de DNA.

Nós desenvolvemos um protocolo detalhado que permite a transfecção rápido e eficiente de várias regiões do cérebro de C57BL / 6 rato ^12. Neste protocolo de informação detalhada sobre as tensões para ser usado e o tamanho do eléctrodo de pá para uma maior especificidade é fornecido. Além disso, as informações sobre o ventrículo para ser preenchido, juntamente com as recomendações para a quantidade de solução de plasmídeo e a posição do eléctrodo é fornecido. A indicação das informações de posição detalhada em um mapa e de uma maior visualização destas posições permite específica simples e eficiente in utero eletroporação do córtex retrosplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme t,cornu Ammonis ele 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral, no tálamo e hipotálamo.

Protocolo

Declaração de Ética: A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as directrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais.

1. In Utero Eletroporação

Nota: No útero electroporação foi realizada como publicado anteriormente ^12,14. Portanto, o método só é descrito resumidamente a seguir (Figura 1).

1. Preparativos
   1. Preparar a solução rápida de cor verde livre de endotoxina avançada plasmídeo transfecção-grade (contendo 1,5 pCAGGS), como descrito anteriormente ^12.
   2. Puxe e moer (35 ° de ângulo de capilares de vidro de borosilicato) (0,8-0,9 de diâmetro) para injectáveis.
   3. Esterilizar instrumentos.
2. Cirurgia
   1. Administrar analgésicos (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, sc, 24 h) depósito, pelo menos, 30 min antes de iniciar a cirurgia.
   2. Manter o comprimento dea anestesia para um máximo de 35-45 min (fase III - fase de anestesia cirúrgica de acordo com a Guedel ¹⁵ - máximo de 25-30 min).
   3. Anestesiar ratos cronometrados grávidas com isoflurano (indução de uma câmara de: 2,8%, a cirurgia por máscara: 2,5%). Confirme anestesia por falta de resposta aos pés-pitada.
   4. Aplicar pomada para evitar a secura ocular durante a anestesia.
   5. Esterilizar a área cirúrgica com 7,5% de solução providona-Iodo e cobrir o mouse com gaze estéril (úmido com solução salina 0,9% benzilo álcool), com apenas a área cirúrgica exposta.
   6. Cortar abrir a cavidade abdominal com um bisturi (incisão na pele: 1.5-2 cm, incisão muscular: 1-1,5 cm).
   7. Preserve a cavidade abdominal aberta de secar umedecendo com solução salina aquecida álcool benzílico a 0,9% ou outra solução isotônica estéril como dirigido por pessoal veterinário ou comitê.
   8. Extrair cuidadosamente cornos uterinos (usando uma pinça de anel, não toque no útero com o dedos).
3. A injecção de ADN e electroporação. Nota: Os detalhes exatos para segmentar regiões específicas são indicadas na secção 2.
   1. Injectar-se lentamente a solução de cor de ADN para o ventrículo como indicado na Figura 1 e da secção 2 através dos capilares de borosilicato preparados.
   2. Aplique a tensão adequada para a fase embrionária correspondente (por exemplo., 36-38 V para E14) através de eletrodos especializados pinças-platina (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, intervalo de pausa 950 ms). As pás de electroporação de pulso durante a aplicação da tensão para minimizar os danos da parede uterina.
4. Publicar eletroporação / cuidados pós-operatórios
   1. Recolocar cuidadosamente os cornos uterinos na cavidade abdominal.
   2. Suturar o músculo e a incisão na pele separadamente.
   3. Deixe o resto do mouse em um dispositivo de suporte térmico para a recuperação.
   4. Supervisionar o mouse durante a recuperação (comportamento, alimentação econsumo de água), 4 horas, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. Se necessário, aplicar analgésicos adicionais (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, 24 horas depósito) para mais 2 dias.

2. A transfecção de áreas cerebrais específicas

Nota: A posição do pólo positivo é mostrado como o ângulo entre a linha de centro vertical através do ventrículo preenchido com a solução de ADN (o ventrículo direito ou terceira) e a posição do pólo positivo. Ao encher o ventrículo esquerdo as posições são invertidas-espelho. Na Figura 4 as posições da orelha primordial são mostrados, que fornecem importantes pontos de referência.

1. A transfecção de áreas corticais (Figura 2A, a Tabela 1).
   1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de áreas corticais utilizar embriões E14.
   2. Injectar 1,5-2 ul de solução de ADN-ADN contendo 4 ug no ventrículo lateral direitoatravés dos capilares de borosilicato preparados.
      1. Posicione cuidadosamente o embrião usando uma pinça anel de modo que não há vasos visíveis acima do local da punção.
      2. Injectar-se lentamente a solução de DNA de aproximadamente 0,75 mm coronal da sutura lambdoidal e 0,5 mm lateral da sutura sagital (Figura 3). Certifique-se que a profundidade de inserção é de 1,2 mm (E14, medido a partir da parede uterina). Verifique se há uma coloração azul-verde com uma demarcação nítida.
   3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 36-38 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos apenas anterior dos primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de uso córtex retrospl�icos 330-0 °, para transfectar o córtex motor 0-40 °, para transfectar o córtex somatossensorial 40-95 °, para transfectaro córtex piriforme 95-110 ° (Figura 2A).
   4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões de 4 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
2. A transfecção do hipocampo (Figura 2B, Quadro 1).
   1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de formação hipocampal utilizar embriões E15.
   2. Injectar-2 uL de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
   3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 38-40.
      3. Colocar o centro do pólo negativo imediatamente anterior à orelha e o primórdio do centro Of o pólo positivo no meio de o primórdio da orelha.
      4. Para transfectar as giro dentado usar ângulos de 190-210 °, para transfectar as Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, para transfectar as CA2 230-250 °, para transfectar as CA1 250-275 ° (Figura 2B).
   4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Análise após a formação do hipocampo completo (após o nascimento, p21) executar conforme descrito na seção 3.
3. A transfecção do núcleo septal lateral e corpo estriado (Figura 2C, Tabela 1)
   Nota: Os ângulos de sobreposição com aqueles para transfecção do hipocampo. Para transfectar eficazmente o núcleo septal lateral e o corpo estriado sem transfecção hipocampo indesejado fases anteriores embrionárias (E12) tem que ser usado.
   1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação in utero do núcleo septal lateral e striathum usar embriões E12.
   2. Injectar 1 ul de solução de ADN-contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
   3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Usar um eléctrodo de 0,5 mm.
      2. Use 33 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos ao nível dos primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de uso do núcleo septal lateral 100-170 °, para transfectar as estriado 170-240 ° (Figura 2C).
   4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
4. A transfecção do tálamo e hipotálamo (Figura 2D, Tabela 1)
   1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para o em Utero eletroporação do tálamo e hipotálamo uso de embriões E12-E13.
   2. Injectar-1-1,5 ul de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral (esquerda ou direita) através de capilares de borosilicato preparados. Espera durante 2-3 min, até a solução se difunde para o terceiro ventrículo. Alternativamente injectar directamente no terceiro ventrículo.
      Nota: Isso melhora especificidade, mas pode causar uma taxa de sobrevivência diminuiu (de alto risco de danos).
   3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Usar um eléctrodo 0,5 ou 3 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 33-35 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos apenas posterior os primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de utilização a partir de 25-40 ° tálamo, para transfectar o hipotálamo 90-180 ° (Figura 2D).
   4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios como descrita no ponto 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.

3. Perfusão Fixation

1. Preparativos
   1. Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C.
   2. Encha uma seringa de 50 ml com PBS (4 ° C) e uma segunda seringa aquecido com PFA. Evite bolhas.
   3. Conecte as seringas a uma torneira de três vias. Conecte o terceiro fim a um conjunto de infusão voada (borboleta).
   4. Lave o conjunto de infusão voado com PBS.
2. Perfusão
   1. Profundamente anestesiar os ratos (ou pós-natal grávida transfectadas) com aplicação subcutânea de cloridrato de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg).
   2. Confirme o estágio de tolerância cirúrgico por falta de resposta aos pés-pitada.
   3. Abra a cavidade abdominal logo abaixo da caixa torácica.
   4. Corte cuidadosamente o diafragma.
   5. Cuidadosamente abra a caixa torácica através de um corte na each local até a clavícula.
   6. Inserir a ponta da borboleta para dentro da câmara do coração esquerdo (a partir do ápice do coração).
   7. Corte o apêndice atrial esquerdo.
   8. Lentamente perfundir o rato com PBS (aproximadamente 10 ml).
   9. Alterne a torneira de três vias.
   10. Perfundir o mouse com 5-10 ml PFA 4%.
   11. Decapitar o mouse com uma tesoura e dissecar o cérebro começando no forame magno. Realize a dissecção como publicado anteriormente ^16.
   12. Postfixate o cérebro por 2 dias em PFA 4%. Manter os cérebros a 4 ° C no escuro.

4. A imuno-histoquímica

1. Gerar 70 um secções (por exemplo, com um vibratome).
2. Opcional: aumentar a fluorescência com coloração de anticorpos.
   1. Bloquear as secções durante 1 hora à temperatura ambiente (0,1-0,2% de Triton X-100, 5% de soro de cabra normal)
   2. Incubar O / N com o anticorpo apropriado (anti-GFP, 1: 1000)
   3. Lavar 3-5 Vezes com tampão de 0,1 M fosfato.
   4. Incubar 3-5 h com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado (Alexa Fluor 488 anti-coelho-IgG conjugada, 1: 1000).
   5. Opcional: contracoloração com 4-6-diaminodino-2-fenilindole (DAPI, 0,2 g / ml em tampão fosfato 0,1 M) durante 1 min.
   6. Analise de fluorescência com um microscópio de fluorescência apropriado.

Resultados

A Figura 2, mostra exemplos para a específica in utero electroporação das regiões em desenvolvimento para o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu Ammonis 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral , o tálamo eo hipotálamo. Os resultados das transfecções são mostrados a seguir ao ângulo recomendado (Figura 2). Para melhor visualização dos ângulos in vivo a posição do eléctrodo (0...

Discussão

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV