코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

요약

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

초록

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

서문

3 개의 독립적 인 그룹 ^1-3에 의해 2001 년 처음 소개 이후 N 자궁 일렉트로는 설치류 중추 신경계에서의 유전자 발현을 분석하기 위해 널리 사용되는 표준 도구가되었다. 지속적으로 개선 기술, 아직 시간과 돈 단순하기 때문에, 자궁 내 전기 호소 소비에도 불구하고,이다 녹아웃 마우스의 세대에 비해. 따라서, 자궁 내 전기는 신속하고 효율적인 이득이 손실-의 기능 연구 ^(4)를 할 수 있습니다.

뇌 영역 트랜, 음으로 하전 된 플라스미드를 함유하는 용액이 뇌실 내로 주입된다. 전기 펄스 동안, 음으로 하전 된 DNA는 양극으로 이동한다 따라서 형질 영역은 양극의 위치를​​ 변경하여 간단하게 선택할 수있다. 그것은 자주 중추 신경계의 다양한 영역 (TA)이 될 수 있음을 보여왔다^3,5-8를 rgeted. 예를 들어, 최근의 연구는 해마, 배 모양의 피질이나 줄무늬 ^9-11의 특정 형질을 보여줍니다. 그러나, 해당 위치에 대한 정보는 거의 종종 표준화되지 않고, 항상 상이한 마우스 균주로 전송할 쉽지 않다.

특정 배아 단계의 형질 사소한는 거리가 멀다. 자궁의 전기의 특정을위한 셋업을 선택할 때 많은 영향을 미치는 요인을 고려해야합니다. 먼저, 각각의 최적 배아 단계 형질, 적절한 전압에 대한 지식이 필요하다. 낮은 전압이 형질 전환 ^효율을 감소 ^2,3,12 반면 고전압은 생존율을 감소시킨다. 또한 전극 패의 크기가 중요한 역할을 감소 특이성에 너무 큰 결과 또는 인해 심장 리듬 ^4,12,13의 애정에 사망에이를 수 있습니다 전극 충격기를 사용하기 때문이다. 적용전압의 크기와 전극 패들의 위치가 고려하는 가장 중요한 특징이지만, DNA-용액의 도포량 같이 전기의 결과에 영향을 미치는 또 다른 요인들도있다.

우리는 C57BL / 6 마우스 ¹² 다양한 뇌 영역의 빠르고 효율적인 형질 있도록 상세한 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜에서 전압에 대한 자세한 정보는 사용되는 향상된 특이성 전극 패들의 크기가 제공된다. 또한, 심실 대한 정보 플라스미드 용액의 양 전극의 위치에 대한 권장 사항이 공급과 함께 충전된다. 지도와 이러한 위치의 더 시각화의 자세한 위치 정보의 표시는 retrosplenial 피질, 운동 피질, 체성 감각 피질, 배 모양의 피질, T의 자궁의 전기에서 간단 구체적이고 효율적으로 할 수 있습니다그는 ammonis 1-3, 치아 이랑 (dentate gyrus), 선조체, 측 중격 핵, 시상과 시상 하부 cornu.

프로토콜

윤리 선언문 : 마우스 및 실험 절차의 처리는 동물 보호에 대한 유럽 국가 및 기관의 지침에 따라 실시 하였다.

1.에서 자궁 Electroporation에

참고 : 이전에 ^{(12, 14)을} 발표 한 자궁 전기에서 수행되었다. 따라서, 상기 방법은 이하의 (도 1)에 간단히 설명 만한다.

1. 준비
   1. 이전 ¹² 설명 된대로 (1,5는 pCAGGS를 포함) 빠른 그린 컬러 독소없는 고급 형질 급 플라스미드 솔루션을 준비합니다.
   2. 주사를위한 (35 ° 각도) 붕규산 유리 모세관 (0.8-0.9 직경)를 당겨 갈기.
   3. 악기를 소독.
2. 외과
   1. 수술을 시작하기 전에 진통제 (카프로 펜, 4 ㎎ / ㎏ 체중, SC, 24 시간 저장소) 적어도 30 분을 관리합니다.
   2. 의 길이를 유지(- 수술 마취의 단계 Guedel ^15에 따라 - 단계 III가 최대 25 ~ 30 분) 35 ~ 45 분의 최대 마취.
   3. (: 마스크를 통해 2.8 %, 수술 : 2.5 % 유도 챔버) 이소 플루 란과 시간이 초과 임신 쥐를 마취. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제로 마취를 확인합니다.
   4. 마취 동안 눈 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
   5. 7.5 % 프로 비돈 - 요오드 용액으로 수술 영역을 소독 노출 만 수술 영역 (0.9 % 벤질 알코올 식염수와 습기) 멸균 거즈와 마우스를 커버한다.
   6. (: 1.5 cm, 근육 절개 : 1.5 cm의 피부 절개) 메스로 복강을 열고 잘라.
   7. 수의학 직원 또는위원회의 지시에 따라 예열 0.9 % 벤질 알코올 식염수 또는 다른 멸균 등​​장 성 용액과 가습에 의해 건조에서 열린 복강을 보존합니다.
   8. 조심스럽게 손가락으로 자궁을 만지지 마십시오, 링 집게 사용하여 자궁 뿔 (추출에스).
3. DNA와 전기 사출. 참고 : 특정 지역을 대상으로하는 정확한 세부 사항은 섹션 2에 표시됩니다.
   1. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 그림 1과 2 절에 표시된대로 천천히 뇌실에 색깔의 DNA 용액을 주입.
   2. 해당 배아 단계에 해당하는 전압을 적용 (예. E14를위한, 36 ~ 38 V) 전문 집게 형 백금 전극 (간격주기 길이 50 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 통해. 질 벽의 손상을 최소화하기 위해 전압의인가시 전기 충격기 펄스.
4. 포스트 전기 / 수술 후 관리
   1. 조심스럽게 복강에서 자궁 뿔을 교체합니다.
   2. 근육과 별도로 피부 절개 봉합.
   3. 복구를위한 열 지원 장치에 마우스 나머지를 보자.
   4. 복구 중에 마우스 (행동, 공급을 감독하고물 소비), 4 시간, 24 시간 및 수술 후 48 시간. 필요한 경우, 추가로 2 일간 추가 진통제 (카프로 펜, 4 ㎎ / ㎏ 체중, 24 시간 저장소)에 적용됩니다.

특정 뇌 영역 2. 형질

주 : 양극의 위치는 DNA 용액 (오른쪽 또는 제 3 뇌실)와 양극의 위치를​​ 가득 뇌실 통해 수직 중심선 사이의 각도로 표시된다. 좌심실을 채울 때 위치는 거울 반전. 도 4에 이어 원시의 위치는 중요한 기준점을 제공하는 나타낸다.

1. 피질 영역의 형질 감염 (도 2A, 표 1).
   1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 대뇌 피질의 영역에서 자궁 전기의 경우 E14 배아를 사용합니다.
   2. 우측 뇌실 4 μg의 DNA를 함유하는 DNA-용액 1.5 μL를 주입준비된 붕규산 모세 혈관을 통해.
      1. 신중 천자 부위 위에 보이는 혈관이 없도록 링 집게를 이용하여 태아의 위치.
      2. 천천히 lambdoidal 봉합에서 약 0.75 mm의 관상면과 시상 봉합 (그림 3)에서 0.5 mm 측면의 DNA 용액을 주입. 삽입 깊이는 1.2 mm (자궁 벽에서 측정 E14가) 있는지 확인하십시오. 날카로운 경계와 파란색 - 녹색 색소를 확인합니다.
   3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 3 5mm 전극 패들을 사용합니다.
      2. 36 ~ 38 V.에 이르기까지 전압을 사용하여
      3. 전극 귀 primordia의 바로 앞쪽의 중심을 놓습니다.
      4. , 운동 피질 0-40 °를 형질 형질, 체성 감각 피질 40-95 °를 형질, 330-0 °에서 retrosplenial 피질의 사용 각도를 형질배 모양의 피질 95-110 ° (그림 2A).
   4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 4 일 분석 할 수 있습니다.
2. 해마 (도 2B, 표 1)의 형질 전환.
   1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 해마 형성의 자궁에 전기를 들어 E15 배아를 사용합니다.
   2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 오른쪽 측면 뇌실에서 4 μg의 DNA를 포함하는 DNA-솔루션 μL 2를 주입.
   3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 3 5mm 전극 패들을 사용합니다.
      2. 38-40 범위의 전압을 사용합니다.
      3. 음극 귀 primordium의 바로 앞쪽의 중심과 중심 (O)를 배치했다귀 primordium의 중간에서 양극 F.
      4. 치아 이랑은 CA1 250-275 ° (그림 2B)를 형질, CA2 230-250 °를 형질, cornu의 ammonis (CA) 3 210-230 °를 형질, 190-210 °에서 각도를 사용하여 형질합니다.
   4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 3 장에 설명 된대로 (출생, P21 후) 완전한 해마 형성 한 후 분석을 수행합니다.
3. 횡 중격 핵 선조체의 형질 감염 및 (도 2C, 표 1)
   참고 : 각도는 해마를 형질에 대한 그와 중첩된다. 효과적으로 측 중격 핵 원치 않는 해마 형질 전환 이전 배아 단계 (E12)없이 선조체를 형질하는 데 사용되어야한다.
   1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 횡 중격 핵과 striat의에서 자궁 전기 용음 E12 배아를 사용합니다.
   2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 오른쪽 측면 뇌실에서 4 μg의 DNA를 포함하는 DNA-솔루션 μL (1)을 주입.
   3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 0.5 mm의 전극을 사용합니다.
      2. 33 (V)를 사용하여
      3. 이어 primordia의 수준에서 전극의 중심을 배치.
      4. 선조체 170-240 ° (그림 2C)를 형질, 100-170 °에서 횡 중격 핵의 사용 각도를 형질합니다.
   4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 6 일 분석 할 수 있습니다.
4. 시상과 시상 하부의 형질 (그림 2D, 표 1)
   1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. U에 들어시상과 시상 하부 사용 E12-E13 배아의 테로의 전기.
   2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 뇌실 (왼쪽 또는 오른쪽) 4 μg의 DNA를 포함하는 1.5 μL의 DNA 용액을 주입한다. 이 솔루션은 제 3 뇌실에 확산 될 때까지 2 ~ 3 분 동안 기다립니다. 다른 방법으로 직접 제 3 뇌실에 주입.
      참고 :이 특이성을 강화하지만 감소 생존율 (손상의 위험이 높은)가 발생할 수 있습니다.
   3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 0.5 3mm 전극을 사용합니다.
      2. 33-35 V.에 이르기까지 전압을 사용하여
      3. 바로 귀 primordia 후부 전극의 중심을 놓습니다.
      4. 시상 하부 90-180 ° (그림 2D)를 형질, 25 ~ 40 °에서 시상 사용 각도를 형질합니다.
   4. DES로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행1.4 절에 cribed. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 6 일 분석 할 수 있습니다.

3. 관류 고정

1. 준비
   1. 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 37 ° C.
   2. PBS로 50 ML의 주사기 (4 ° C) 및 예열 PFA와 두 번째 주사기를 입력합니다. 거품을 피하십시오.
   3. 세 방향 꼭지에 주사기를 연결합니다. 날개 달린 주입 세트 (나비)에 세 번째 끝을 연결합니다.
   4. PBS로 날개 달린 주입 세트를 플래시합니다.
2. 관류
   1. 깊이 피하 케타민 염산염의 응용 프로그램 (60 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7.5 ㎎ / ㎏)와 (임신 또는 출생 후의 형질) 마우스를 마취.
   2. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제로 수술 허용 단계를 확인합니다.
   3. 바로 흉곽 아래 복강을 엽니 다.
   4. 조심스럽게 다이어프램을 잘라.
   5. 조심스럽게 전자에 컷을 통해 흉곽을 열고쇄골까지 ACH 사이트.
   6. (심장의 정점에서 시작) 왼쪽 심장 챔버로 나비의 끝을 삽입합니다.
   7. 좌심방을 잘라.
   8. PBS 천천히 (약 10ml)로 마우스를 관류.
   9. 삼방 코크 스위치.
   10. 5 ~ 10 ml의 4 % PFA와 마우스를 관류.
   11. 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨과 난원 매그넘에서 시작 뇌를 해부하다. 이전에 ^(16)이 발표 한 절개를 수행합니다.
   12. 4 % PFA 2 일 동안 뇌를 Postfixate. 어둠 속에서 4 ° C에서 머리를 유지합니다.

4. 면역 조직 화학

1. (vibratome와 예) 70 μm의 섹션을 생성합니다.
2. 옵션 : 항체 염색 형광을 향상시킬 수 있습니다.
   1. RT에서 1 시간 동안 차단 부 (0.1-0.2 % 트리톤 X-100, 5 % 정상 염소 혈청)
   2. 적절한 항체 (1,000 방지 GFP, 1)로 O / N을 품어
   3. 워시 30.1 M 인산 완충와 -5 번.
   4. 적절한 형광 - 복합 이차 항체 (1,000 알렉사 플 루어 488 복합 항 - 토끼 IgG를, 1)과 3-5 시간을 품어.
   5. 선택적 : 1 분간 (0.1 M 인산 완충액 DAPI, 0.2 g / ㎖) 4-6-diaminodino -2- 페닐 인돌로 Counterstain과.
   6. 적절한 형광 현미경으로 형광을 분석 할 수 있습니다.

결과

그림 2, retrosplenial 피질로 개발 지역의 자궁 전기의 특정에 대한 예를 보여줍니다, 운동 피질, 체성 감각 피질, 배 모양의 피질, cornu가 1-3 ammonis, 치아 이랑 (dentate gyrus), 선조체, 횡 중격 핵 , 시상과 시상 하부. 형질 감염의 결과는 권장 각도 (도 2) 다음에 나타낸다. 생체 내에서 각의 더 나은 시각화를위한 전극 (0.5 mm)의 위치도 (양막 낭 그림 5, ...

토론

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV