在气味引导行为的高分辨率定量<em&gt;果蝇</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;范式

摘要

自动跟踪系统Flywalk是用于在果蝇气味引导行为高分辨率定量。

摘要

在自然环境中，昆虫等的飞醋果蝇轰炸了大量的不同化学气味物质。为了进一步使问题复杂化，由昆虫的神经系统检测到的气味通常不是单一化合物而是混合物，其成分和浓度比例有所不同。这导致具有由神经系统进行评估不同嗅觉刺激的几乎无限量。

为了理解其中的刺激气味的各方面通过飞确定其评价，因此，希望能够有效地检查气味引向许多增味剂和气味的混合物的行为。要直接关联的行为神经元的活动，行为应该量化可比较的时间框架，并在相同的刺激条件下在神经生理学实验。然而，在果蝇神经行为学许多目前使用的嗅觉生物测定相当斯佩恰lized无论是对效率或实现的分辨率。

Flywalk，一个自动气味递送和跟踪系统，桥梁效率和分辨率之间的差距。它允许什么时候气味包刺激了行走自如飞行，并确定宠动态行为反应的决心。

引言

任何神经行为学研究的总体目标是建立单个神经元或神经元电路的活动状态和生物体的行为之间的因果关系。为了实现这一目标的神经元活动和行为应该在相同的激励条件被监控并且这些刺激条件下理想地应当类似于受到审查神经系统发展到使感。特别是当它涉及到行为的生物测定，这些需求在历史上被证明相当苛刻果蝇嗅觉神经行为学。

一旦从源释放，气味羽状迅速分解成薄细丝造成空气运动是气味分布¹的主要决定因素湍流扩散。其结果是，昆虫导航朝向气味源经历间歇刺激与穿插的洁净空气可变间隔气味包。都步行和飞行昆虫-包括果蝇 -已被证实通过在羽遭遇逆风飙升，主要是移动的侧风在没有气味²利用这一间歇刺激制度导航^{- 5。}而在生理实验刺激程序基本上模仿那些昆虫可以通过提供单个抽吸气味穿插的洁净空气或动态刺激序列⁶长时间在其天然环境体验^{- 11，}许多行为的生物测定在果蝇神经行为使用，诸如阱测定，旷场阿里纳斯或T型迷宫依靠气味梯度的^{12 - 15。}但是，由于气味梯度的定义是在浓度可变根据来自气味源的距离，特定行为不能归因于使用这些范例精确臭气浓度。另外，该斜率气味梯度关键取决于臭气物质的物理化学性质。高挥发性化合物的梯度将比由低挥发性化合物创建并因此也更难跟踪生物体依靠测量浓度差在空间导航¹⁶的唯一手段较浅^{- 20，}这可能导致一个曲解嗅觉喜好特别是在选择检测。这个效果也非常有害调查朝气味的混合物时的行为，因为它导致不同混合组分比率在空间中的每个点，因此，再次排除生理和行为之间有明显的相关性。

虽然醋蝇倾向于聚集在发酵的水果，它们是独居在他们对食品来源和产卵场所导航。然而，用在果蝇 neuroetholo而不是测试个别动物的许多行为范式gy的检查蝇同伙的气味引导行为和吸引力的得分为苍蝇选择气味过控制刺激的分数。这些人群实验极大地促进了飞神经行为学的理解，许多使用他们提出的意见可以在单飞行实验来证实。然而，已经观察到，苍蝇可以影响每个other's ^第 21和在极端情况下的气味的评价，可以从漠不关心切换撤销取决于人口密度^22。此外，从这类实验结果往往提供的行为决定，而不是观察什么苍蝇做，而它是这样做，试图与相关神经元活动的行为时，这将是可取的序列的只有终点。这些相当低解析度人群实验由高分辨率的单飞的方法，例如允许系留飞行竞技场和跑步机对比在当时直接观察的行为反应刺激呈现^20,23,24。然而，队列实验仍然很受欢迎，因为他们是非常有效的，并提供强大的结果，即使在相对较低的样本大小，因为个体间和审间的变化被部分平均出由于观察人口过长时间。而系留飞行和跑步机可能提供关于刺激呈现和时间分辨率的金标准，所使用的领域被设计用于单一动物并且因此费时，得到样品大小所需的统计分析。若干其他方法最近已开发出允许一个高效采集高分辨率行为数据的结合定义良好的刺激机制。这些包括无监督3D跟踪多个醋蝇在风洞中组合与气味羽⁵的精确的3D模型，多个单独的苍蝇在气流从两侧^25和 Flywalk范例^26供应商会选择跟踪。

在Flywalk，15个人的苍蝇都坐落在小玻璃管，并通过高架摄像头下的红色光条件下连续监测。气味被添加到20厘米/秒的连续气流，并通过玻璃管以恒定的速度行进。气流是通过250毫升瓶进入气味输送系统之前，含蒸馏水（加湿器）传递给它加湿。所述flies'位置的感兴趣区（ROI）包围大部分的气味管的长度（但不包括管子（大约5毫米处每侧的外边缘的正方形区域），其中所述蝇不能移动进一步上调或内记录顺风）周围气味介绍（图1A，B）的时间。飞身份保持恒定由跟踪系统吨hroughout与其Y位（即他们的玻璃管限制）的基础上进行实验。刺激气味是使用一种多组分的刺激装置，该装置允许多达8个单气味和所有可能的混合物^26,29（图1B）的介绍实现。一个实验的过程是由计算机调节气味递送系统以及收集的温度和湿度信息（计算机1， 图1C）来控制。这台计算机还控制数据记录器（开始/停止录音）它连续不断地跟踪每秒20帧（电脑2）飞行位置的第二台计算机上。飞位置，气味阀门状态（ 即时间点阀门开度），气味ID，温度和湿度周围的气味刺激周期登录计算机2这样的信息对气味和飞位置是同步的，并出口为.csv文件，文件，这可进一步加工，并使用自定义编写分析程序进行分析。因为整个系统是计算机控制的，没有人的干预的实验会话期间是必要的。

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研究方案

Flywalk的结构和技术细节已描述在别处^26（如果是建立这一设置，进一步的信息可以从MK获得的任何问题）。在这里，我们重点的模式，这将有助于获得可靠的结果的处理的详细说明。

1.飞处理

1. 后飞低到下一个12小时的食品中²⁷中密度培养:12小时暗条件在23-25℃，相对湿度70％。为此，让20-30新出现的成蝇在一个大的食品小瓶重现1周，然后丢弃成蝇，等待后代出现。
2. 收集30-40新兴（年龄<24小时），成蝇和年龄他们在新的含食物中²⁷ 3-5天小瓶。
3. 二十四小时的行为实验开始前:传输所有30-40以前收集3-5日龄（见2.2）飞往新VI含有人潮湿橡胶泡沫塞或使用吸气湿润薄纸。
   注意:不要麻醉苍蝇用CO _2。

2.制备Flywalk设置的

1. 使用250毫升瓶作为加湿器。填加湿器用100ml蒸馏水。
2. 准备气味瓶。
   1. 制备500μl的¹⁰ -3稀释液的纯气味乙酸乙酯，丁酸乙酯，乙酸异戊酯和2,3-丁二酮在溶剂中的矿物油。
   2. 附加每气味瓶两分球止回阀。需要注意的是单向阀只允许单向气流。因此，连接止回阀在空气能够进入所述小瓶在一侧并使其保持在另一侧这样的方式。
   3. 除去200μl的PCR反应管的盖子。吸液管将100μl每气味稀释到一个单独的反应管，并将管在分开的气味小瓶中。还要准备一种气味瓶中只含有溶剂的矿物OI湖
   4. 紧紧通过关闭他们使用不锈钢插头和橡胶垫圈密封气味小瓶。
   5. 连接5气味小瓶（4含有气味和含有1矿物油中）的气味传递系统。请务必将其连接在正确的流向。一个错误的连接，不仅损害计划实验，但它也有可能污染递送系统。
3. 通过密封刺激装置的混合室的出口检查是否泄漏。确保，该刺激装置前，所有现在的气流逐步降为零。如果不是，检查它现在可以通过空气中的嘶嘶声使系统来识别泄漏。
4. 小心地使用传输双方使用相应的适配器吸气，靠近玻璃管15个人苍蝇至15个人的玻璃管。
   注:由于系统必须密封成功的实验，确保适配器适合玻璃管紧并注意玻璃管可以在这一步打破。小心避免受伤戴防护手套和护目镜。
5. 连接玻璃管的Flywalk设置，并从这里开始，等待至少15分钟开始实验，让果蝇使其习惯新环境之前。
6. 附玻璃管后:检查计算机1上的下行数字流量计的读出，如果玻璃管后16气流加起来进入系统的气流。还检查计算机1上，如果湿度为60％和80％。
7. 设计激励协议​​控制呈现给苍蝇的刺激气味的顺序和定时。同时获得例如所描述的数据，本4气味和控制（矿物油）单独使用及所有可能的三元和气味的季混合物为每个40次。设定脉冲持续时间，以500毫秒，在90秒的刺激间隔和随机激励序列。
8. 接通李GHT源（LED集群;λ= 630）。确保提供足够的光线进行有效跟踪，而不增加玻璃管内的温度。
9. 通过拖动帧跨过区域中，所有15玻璃管包含这样的方式被监视和大约5毫米的管的边缘被排除设置的跟踪系统的感兴趣区域。
10. 成立于跟踪系统各个管之间的平行14分线，通过改变它们的Y位置在相应的脚本，以保持个人的整个实验过程中苍蝇识别。务必将其以这样的方式定位总是有两个这样隔线之间的一个玻璃管中，因为只有一个飞将任何一组的两行之间进行跟踪。
11. 确保在苍蝇可靠地跟踪整个玻璃管这样的方式设置相机参数。如果蝇丢失在感兴趣区域的边缘，增加亮度的跟踪s或增益oftware。避免机械跟踪系统的振动。跟踪根据制造商的方案使用商业软件。
12. 通过启动经济刺激方案开始实验。记录flies' XY坐标在20 FPS（每秒帧数），并登录在文本文件中的气味阀门状态组合。

3.数据分析

注:在数据分析下面的步骤是使用在R编程自定义编写例程automatized因为这些步骤是关键，得到分析将仍然在一步一步地被呈现有意义的结果。的原始数据的分析是含有上气味阀状态，脉冲数在实验和15飞的x位置，以cm，并持续一个刺激气味周期共同的时间轴同步信息的.csv-文件。根据要求可以提供数据分析的自定义代码。

1. 开放的.csv文件，发现时间点阀的开度由茶所指的NGE在代表阀门状态列。
2. 计算的形式的气味位置的线性函数
   F（T）= S * T + I
   其中t是时间的刺激循环，s是风速（此处20个厘米/秒），我可以利用时间点的气味进入管在位置0（开阀加上延迟）来计算截距。
3. 寻找在该气味的时间点和飞行x位置相交，每飞行，并将此时间点为0。注:这种方式飞行位置对准每个individual's遇到的气味。
4. 排除蝇坐在感兴趣区域的非常边缘。
5. 通过将沿x轴位移的时间间隔（100毫秒），并重复步骤为每个刺激周期来计算速度从X位置。
6. 以获得速度时道，如图2E计算平均速度的时间-过程为每个蝇和气味，并从那些平均时间过程对于给定的气味。
7. 气味脉冲对每个跟踪事件，之后每苍蝇和气味的平均净位移后，得到净位移，如图3C计算4秒钟内的净位移。

4.清洗程序

1. 清洁玻璃管
   1. 从玻璃管中取出的苍蝇和适配器泡的玻璃管洗涤剂。
   2. 冲洗玻璃管下运行的蒸馏水，用压缩空气干燥。
   3. 热玻璃管，在200℃8小时。
2. 清洁气味输送系统
   1. 从中央混合室中取出所有的气味瓶和管道。
   2. 从混合室中取出管道适配器。
   3. 清洁混合室通过用实验室清洗溶液和溶剂（如乙醇，丙酮）漂洗。执行实验室引擎盖下这些步骤。
   4. 利用干式混合室的加压空气和加热它在200℃8小时。
3. 清洁气味瓶和止回阀
   1. 卸下钢塞（丢弃橡胶垫圈），并检查从气味瓶阀门，浸泡所有组件在实验室的清洁液。
   2. 在超声浴中超声处理元件和冲洗它们用蒸馏水。
   3. 清洗除了用乙醇和丙酮止回阀所有组件。执行实验室引擎盖下这些步骤。
   4. 使用加压空气和干燥部件加热它们在200℃下8小时。
   5. 上的内部的清洁单向阀通过用乙醇和使用注射器丙酮冲洗它们（考虑流动方向）。执行实验室罩戴护目镜实验室根据这些步骤。由于丙酮用压缩空气冲洗他们攻击橡胶件，立刻干止回阀。
   6. 通过脉冲空气通过单向阀几天清除残留异味。此清洗步骤中使用的培养箱，在60℃，1秒的空气上/ 1秒的空气断制度。

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结果

因为果蝇被允许通过玻璃管气味脉冲和气味脉冲行进之间自由分发他们的玻璃试管内以恒定的速度苍蝇遇到气味在不同的时间取决于它们的x位置处的刺激的时间。其结果是，通过一个有吸引力的¹⁰ -3稀释的乙酸乙酯的500毫秒脉冲诱发逆风轨迹的起始点是由约1秒，在他们的玻璃管的顺风端相比，这些苍蝇坐在接近的延迟为蝇逆风端以20厘米/秒和20厘米的玻璃管长度（图2A）的风?...

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讨论

虽然Flywalk系统似乎相当复杂乍看之下，一旦建立并运行它易于使用，并产生非常强大的结果。强调与生物测定所产生的结果的一致性，可以说的是，这里示出的代表性的结果差不多2年后一些与使用新的跟踪软件和光源的变形设置示出在先前的研究²⁹的结果获得的。尽管如此，引诱反应是 - 尽管略高反应振幅 - 非常类似于以前发表的关于他们的动态。

有哪些应被视为?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany