Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Riepilogo

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Abstract

Nel loro ambiente naturale, insetti come l'aceto mosca Drosophila melanogaster sono bombardati da una quantità enorme di odoranti chimicamente distinti. Per complicare ulteriormente le cose, gli odori rilevati dal sistema nervoso degli insetti non sono solitamente composti singoli ma miscele la cui composizione e rapporti di concentrazione variare. Questo porta ad una quantità quasi infinita di diversi stimoli olfattivi che devono essere valutata dal sistema nervoso.

Per capire quali aspetti di uno stimolo odore determinano la sua valutazione da parte del volo, è pertanto auspicabile esaminare in modo efficiente il comportamento odore-guidati verso molte odoranti e miscele odore. Per correlare direttamente comportamento da attività neuronale, comportamento dovrebbe essere quantificato in un lasso di tempo comparabile e in condizioni di stimolo identiche in esperimenti neurofisiologici. Tuttavia, molti test biologici olfattivi attualmente utilizzati in Drosophila neuroetologia sono piuttosto speciazato sia verso l'efficienza e verso la risoluzione.

Flywalk, un sistema di erogazione di odore e automatizzato di monitoraggio, colma il divario tra efficienza e risoluzione. Esso permette di determinare esattamente quando un pacchetto odore stimolato una mosca liberamente a piedi, ea quali per animali da reazione dinamica comportamentale.

Introduzione

L'obiettivo primario di ogni ricerca neuroethological è di stabilire un nesso di causalità tra gli stati di attività dei singoli neuroni o circuiti neuronali e il comportamento di un organismo. Per raggiungere questo obiettivo l'attività neuronale e comportamento devono essere monitorati in condizioni di stimolo identiche e queste condizioni di stimolo dovrebbe idealmente essere simili a quelle del sistema nervoso sotto controllo evoluto per dare un senso. Soprattutto quando si tratta di saggi biologici comportamentali, questi requisiti hanno storicamente dimostrato abbastanza esigente in Drosophila melanogaster neuroetologia olfattiva.

Una volta liberato dalla fonte, pennacchi odore rapidamente si disgregano in filamenti sottili con diffusione turbolenta causato dal movimento dell'aria è il principale determinante della distribuzione odori ^1. Come risultato, un insetto navigazione verso una fonte di odore sperimenta stimolazione intermittente con pacchetti odore intervallati da intervalli variabili di aria pulita. Entrambe le particamminare e insetti volanti - tra Drosophila - sono stati dimostrati per sfruttare questo regime stimolazione intermittente per la navigazione da aumento di bolina su incontro pennacchio e prevalentemente in movimento vento di traverso, in assenza di odori ^{2 - 5.} Considerando che le procedure di stimolazione negli esperimenti fisiologici ampiamente imitare quelli di un insetto che si verifichi nel suo ambiente naturale dovendo provvedere a singoli sbuffi di odori intervallati da lunghi periodi di aria pulita o sequenze di stimolazione dinamiche ^{6 - 11,} molti test biologici comportamentali utilizzate in Drosophila neuroetologia quali test trappola , arene campo aperto o T-labirinto si affidano a odori-gradienti di ^{12 - 15.} Tuttavia, perché gradienti odore per definizione sono variabili in concentrazione in funzione della distanza dalla sorgente di odore, un particolare comportamento non può essere attribuito ad una concentrazione di odore preciso usando questi paradigmi. Inoltre, la pendenzaun gradiente di odore dipende in modo critico sulle proprietà fisico-chimiche del odorizzante. Un gradiente di un composto altamente volatile sarà meno profonda di quella generata da un composto meno volatile e quindi anche più difficile da monitorare per un organismo basandosi sulla misurazione differenze di concentrazione nello spazio come unico mezzo di navigazione ^{16 - 20,} che può portare ad una errata interpretazione delle preferenze olfattive particolarmente nei saggi di scelta. Questo effetto è anche molto dannoso nell'ambito delle indagini comportamento verso miscele odore perché porta a rapporti dei componenti si fondono diverse in ogni punto dello spazio e quindi di nuovo preclude una chiara correlazione tra fisiologia e del comportamento.

Mentre le mosche aceto tendono ad aggregarsi in fermentazione di frutta, che sono solitari nella loro navigazione verso fonti di cibo e siti deposizione delle uova. Tuttavia, invece di test singoli animali molti paradigmi comportamentali utilizzati in Drosophila neuroethology esaminare il comportamento di odore-guidata delle coorti di mosche e di attrazione è segnato come la frazione di mosche che scelgono l'odore su uno stimolo di controllo. Questi esperimenti di coorte hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mosca neuroetologia e molte delle osservazioni fatte con il loro impiego potrebbe essere confermato in esperimenti di singolo-fly. Tuttavia, è stato osservato che vola può influenzare ogni decisione other's ²¹ e in casi estremi la valutazione di un odore può passare da indifferenza all'annullamento seconda densità di popolazione ^22. Inoltre, i risultati di questi tipi di esperimenti spesso forniscono solo il punto finale di una sequenza di decisioni comportamentali piuttosto che osservando ciò al volo sta facendo mentre lo fa, che sarebbe desiderabile quando si tenta di correlare comportamento con attività neuronale. Questi esperimenti di coorte piuttosto bassa risoluzione si contrappongono ad alta risoluzione metodi single-fly, come arene dei voli frenati e tapis roulant che permettonoper l'osservazione diretta delle risposte comportamentali al momento lo stimolo viene presentato ^20,23,24. Tuttavia, gli esperimenti di coorte sono ancora popolari, perché sono molto efficienti e di risultati solidi anche a dimensioni comparabile bassa del campione perché la variabilità inter-individuale e inter-trial sono parzialmente in media a causa all'osservazione delle popolazioni per lunghi periodi di tempo prolungati. Mentre volo tethered e tapis roulant probabilmente offrono il gold standard per quanto riguarda la presentazione dello stimolo e risoluzione temporale, arene utilizzati sono progettati per singoli animali ed è quindi in termini di tempo per ottenere le dimensioni necessarie campione per un'analisi statistica. Molti altri approcci sono stati recentemente sviluppato che permettono una efficiente acquisizione di dati comportamentali ad alta risoluzione in combinazione con un regime di stimolo ben definita. Questi includono non supervisionato tracking 3D di più mosche di aceto in una galleria del vento in combinazione con un accurato modello 3D del pennacchio odore di ⁵ , il monitoraggio di più mosche singoli nelle camere a scelta in dotazione con correnti d'aria da entrambi i lati ^{25 e} il paradigma Flywalk ^26.

In Flywalk, 15 mosche individuali si trovano in tubi di vetro di piccole e costantemente monitorate da una telecamera dall'alto in condizioni a luci rosse. Gli odori vengono aggiunti ad un flusso d'aria continuo di 20 cm / sec e viaggiano attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante. Il flusso d'aria viene umidificata mediante passaggio 250 ml bottiglie contenenti acqua distillata (umidificatori) prima di entrare nel sistema di erogazione odore. Le posizioni flies' vengono registrati all'interno di una regione quadrata di interesse (ROI) comprendente la maggior parte della lunghezza dei tubi di odore (esclusi i bordi esterni dei tubi (circa 5 mm su ciascun lato) dove le mosche non possono muoversi ulteriormente alto o sottovento) intorno al momento della presentazione dell'odore (Figura 1A, B). Fly identità sono mantenuti costanti dal sistema di tracciamento tel corso l'esperimento sulla base delle loro posizioni Y (vale a dire i loro limiti tubo di vetro). Stimolazione odore si ottiene utilizzando un dispositivo di stimolo multi-componente che permette la presentazione di fino a 8 singoli odori e tutte le possibili miscele ^26,29 (Figura 1B). Il corso di un esperimento è controllato da un computer regolando il sistema di erogazione odore e raccolta di temperatura e umidità informazioni (computer 1, Figura 1C). Questo computer controlla anche un datalogger (avvio / arresto della registrazione) su un secondo computer, che registra continuamente posizioni mosca a 20 fotogrammi al secondo (computer 2). Vola posizioni, stato della valvola odore (cioè il tempo-punto di apertura della valvola), ID odore, temperatura e umidità intorno cicli di stimolazione odore è registrato sul computer 2. In questo modo le informazioni su odore e volare posizioni sono sincronizzati ed esportati come file .csv-che possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando routine di analisi-custom scritta. Perchél'intero sistema è controllato da computer, è necessario alcun intervento umano durante una sessione sperimentale.

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Protocollo

La costruzione e dettagli tecnici di Flywalk sono state descritte altrove ²⁶ (in caso di eventuali problemi di stabilire questo set up, ulteriori informazioni possono essere ottenute da MK). Qui ci concentriamo su istruzioni dettagliate sulla gestione del paradigma che aiuterà ad ottenere risultati affidabili.

1. Fly Handling

1. Posteriore vola in basso a culture media densità su supporto alimentare ²⁷ sotto una 12 ore: 12 ore di luce: regime buio a 23-25 ​​° C e 70% di umidità relativa. A tal fine, lasciare 20-30 adulto di recente è emerso vola a riprodurre in una grande fiala cibo per 1 settimana, poi scarta mosche adulte e aspettare che la prole di emergere.
2. Raccogliere 30-40 nuovi emersi (età <24 ore) mosche adulte e invecchiare in in nuovo un flaconcino contenente mezzo cibo ²⁷ per 3-5 giorni.
3. Ventiquattro ore prima dell'inizio dell'esperimento comportamentale: Trasferire tutto 30-40 precedentemente raccolto 3-5 d vecchio (vedi 2.2) vola a un nuovo VIAl contenente un tappo di gomma di schiuma umida o un fazzolettino di carta umida con un aspiratore.
   NOTA: non anestetizzare le mosche con CO _2.

2. Preparazione del Setup Flywalk

1. Utilizzare bottiglie da 250 ml come umidificatori. Riempire umidificatori con 100 ml di acqua distillata.
2. Preparare fiale odore.
   1. Preparare 500 microlitri 10 ^-3 diluizioni del odori puri acetato di etile, butirrato di etile, acetato e 2,3-isopentil butanedione in olio minerale solvente.
   2. Collegare due valvole di ritegno a sfera per l'odore fiala. Notare che il check valvole consentono solo per il flusso d'aria unidirezionale. Pertanto, collegare valvole di ritegno in modo tale che l'aria possa entrare nel flaconcino da un lato e lasciarla sull'altro lato.
   3. Rimuovere il coperchio di un tubo di reazione 200 microlitri PCR. Pipetta 100 ml di ogni diluizione odore in un tubo di reazione separata e posizionare i tubi in flaconi odore separati. Anche preparare un flaconcino contenente solo l'odore oi minerali solventel.
   4. Strettamente sigillare le fiale odore chiudendo utilizzando tasselli in acciaio inox e guarnizioni in gomma.
   5. Collegare i 5 flaconcini odore (4 contenente odori e 1 contenenti olio minerale) al sistema di erogazione odore. Assicurati di collegarli in direzione del flusso destra. Un collegamento errato non solo compromettere l'esperimento previsto, ma può anche contaminare il sistema di erogazione.
3. Controllare eventuali perdite sigillando l'uscita della camera di miscelazione del dispositivo stimolo. Assicurarsi che tutti i flussi d'aria prima che il dispositivo di stimolo ora progressivamente scendono a zero. In caso contrario, controllare le perdite che possono ora essere identificati con il sibilo dell'aria in uscita dal sistema.
4. Trasferire accuratamente 15 mosche individuali a 15 tubi in vetro individuo che usa un aspiratore e tubi di vetro chiudere su entrambi i lati con le schede corrispondenti.
   Nota: Poiché il sistema è chiuso ermeticamente per esperimenti di successo, in modo che le schede si adattano tubi di vetro ermeticamentee notare che tubi di vetro può rompersi durante questa fase. Fare attenzione per evitare lesioni indossando guanti e occhiali protettivi.
5. Collegare i tubi di vetro al setup Flywalk e, da qui in poi, attendere almeno 15 minuti prima di iniziare l'esperimento per consentire le mosche abituare al nuovo ambiente.
6. Dopo aver collegato i tubi di vetro: controllare le letture dei misuratori di portata a valle digitali sul computer 1 se i 16 flussi d'aria dopo i tubi di vetro si sommano al flusso d'aria che entra nel sistema. Verificate anche sul computer 1, se l'umidità è tra il 60% e l'80%.
7. Progettazione protocollo stimolo controllare la sequenza e la tempistica di stimoli odore presentati alle mosche. Per ottenere ad esempio i dati descritti, presenti 4 odori e controllo (olio minerale) e singolarmente tutti i possibili ternari e quaternari miscele degli odori contemporaneamente per 40 volte ciascuno. Impostare la durata dell'impulso di 500 ms ad un intervallo di 90 secondi interstimulus e casuale sequenza di stimolo.
8. Accendere il lifonte GHT (-cluster LED; λ = 630). Assicurati di fornire abbastanza luce per il monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all'interno dei tubi di vetro.
9. Impostare una regione di interesse del sistema di tracciamento trascinando una cornice all'interno dell'area da monitorare in modo tale che tutti i tubi di vetro 15 sono inclusi e sono esclusi circa 5 mm dei bordi dei tubi.
10. Impostare 14 linee di separazione parallele tra singoli tubi del sistema di tracciamento modificando le loro posizioni Y nello script corrispondente per mantenere individuale vola identificabile tutto l'esperimento. Assicurarsi di posizionarli in modo tale che vi sia sempre un tubo di vetro tra due di tali linee di separazione, perché solo uno volare verrà tracciato tra qualsiasi insieme di due linee.
11. Assicurarsi di impostare i parametri della telecamera in modo tale che le mosche sono tracciati affidabile durante i tubi di vetro. Se mosche sono persi ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o guadagno del monitoraggio software. Evitare vibrazioni meccaniche del sistema di tracciamento. Traccia utilizzando il software commerciale secondo il protocollo del produttore.
12. Inizia esperimento avviando il protocollo stimolo. Record flies' XY-coordinate a 20 fps (fotogrammi al secondo) e accedere in combinazione con lo stato della valvola odore in file di testo.

Analisi 3. Dati

NOTA: Le seguenti operazioni nell'analisi dei dati sono automatizzate utilizza le routine custom scritti programmati in R. Poiché questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati significativi l'analisi sarà comunque presentata in modo step-by-step. I dati grezzi per l'analisi sono CSV-file contenenti informazioni sincronizzate sullo stato della valvola odore, il numero di impulsi nell'esperimento e 15 fly x posizioni in cm su un asse temporale comune per un odore ciclo di stimolazione. Codice personalizzato per l'analisi dei dati può essere fornita su richiesta.

1. Aperto .csv file, trovare il tempo-punto di apertura della valvola significato da un chaESN nella colonna che rappresenta lo stato della valvola.
2. Calcolare la funzione lineare della posizione dell'odore della forma
   f (t) = s * t + i
   dove t è il tempo nel ciclo di stimolazione, s è la velocità del vento (qui 20 cm / sec) e l'intercetta i può essere calcolata usando il time-point l'odore entra nelle provette a posizione 0 (apertura della valvola più ritardo).
3. Trovare il punto in cui l'odore tempo e volare x-position si intersecano per ogni mosca e impostare questo time-point a 0. Nota: In questo modo le posizioni mosca sono allineate ad ogni individual's incontro con l'odore.
4. Escludi mosche seduti ai bordi molto della regione di interesse.
5. Calcolare la velocità da X-posizioni dividendo spostamento lungo l'asse x per l'intervallo di tempo (100 msec) e ripetere la procedura per ogni ciclo di stimolazione.
6. Per ottenere temporali corsi velocità come mostrato nella Figura 2E calcolare medio di time-course velocità per ogni mosca e odore e da quelle del time-course medio per un determinato odore.
7. Per ottenere lo spostamento netto come mostrato in Figura 3C calcolare lo spostamento netto entro 4 secondi dopo l'impulso odori per ogni evento di inseguimento e successivamente lo spostamento netto medio per volo e odore.

4. Procedura di pulizia

1. Clean Glass Tubes
   1. Rimuovere le mosche e gli adattatori da tubi di vetro e godersi tubi di vetro con detergente.
   2. Sciacquare tubi di vetro con acqua corrente distillata e asciugarle con aria compressa.
   3. Tubi di vetro termico a 200 ° C per 8 ore.
2. Pulire Odore Delivery System
   1. Rimuovere tutti i flaconi di odori e tubi dalla camera di miscelazione centrale.
   2. Rimuovere adattatori tubi dalla camera di miscelazione.
   3. Pulire camera di miscelazione con il risciacquo con soluzione detergente laboratorio e solventi (ad esempio etanolo, acetone). Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio.
   4. Camera di miscelazione a secco con aria pressurizzata e riscaldarlo a 200 ° C per 8 ore.
3. Pulire Odore Fiale e Valvole
   1. Togliere il tappo in acciaio (guarnizione in gomma di scarto) e valvole di non ritorno di fiale di odori e godersi tutti i componenti nella soluzione detergente laboratorio.
   2. Componenti Sonicare in un bagno a ultrasuoni e sciacquare con acqua distillata.
   3. Pulire tutti i componenti ad eccezione di valvole di non ritorno con etanolo e acetone. Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio.
   4. Componenti asciugare con aria compressa e di riscaldare a 200 ° C per 8 ore.
   5. Valvole di ritegno pulito dentro di loro lavaggio con etanolo e acetone utilizzando una siringa (ritengono direzione del flusso). Eseguire queste operazioni sotto il cofano laboratorio indossare occhiali di laboratorio. Perché acetone attacca parti in gomma, immediatamente valvole di ritegno a secco da vampate di calore con aria compressa.
   6. Rimuovere odori residui da pulsare aria attraverso le valvole di ritegno per diversi giorni. Utilizzare un incubatore a 60 ° C ed aria 1 sec acceso / 1 sec aria fuori regime per questa fase di pulizia.

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Risultati

Poiché mosche possono distribuire liberamente all'interno dei tubi di vetro tra impulsi odore e l'impulso odore viaggia attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante mosche incontrano l'odore in tempi diversi a seconda della loro posizione x al momento della stimolazione. Come risultato, le esacerbazioni delle traiettorie controvento evocati da un impulso di 500 msec di un attraente 10 ^-3 diluizione di acetato di etile sono ritardate di circa 1 sec per mosche alla fine sottovento loro tubi...

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Discussione

Anche se il sistema Flywalk appare piuttosto sofisticato, a prima vista, una volta istituito e funzionante, è facile da usare e produce risultati molto robusti. Per sottolineare la coerenza dei risultati ottenuti con il saggio biologico si può dire che i risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti quasi 2 anni dopo alcuni dei risultati riportati in un precedente studio ²⁹ con una configurazione modificata utilizzando un nuovo software di monitoraggio e la sorgente luminosa. Tuttavia, le risposte...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany